İçeriğe atla

Yeni nesil dizileme

Yeni nesil dizileme; DNA, RNA dizileme ve varyant / mutasyon tespiti için yeni bir teknolojidir.[1] Yeni nesil dizileme aynı zamanda büyük paralel sıralama veya ikinci nesil sıralama olarak da adlandırılmaktadır.[2] Yeni nesil dizileme, DNA fragmanlarını (veya tamamlayıcı DNA'yı) aynı anda sıralamanın bir yöntemidir.[3] Milyonlarca ila milyarlarca DNA nükleotidi paralel olarak sıralanabilmektedir. Giga baz boyutta okumaları oluşturmak için gereken süre yalnızca birkaç gün veya saattir.[4] Parça klonlama yöntemlerine (bkz: Sanger dizilemesi) olan ihtiyacı en aza indirmektedir. Ayrıca, önemli ölçüde daha fazla verim sağlanmaktadır.[5] İlk ticari yeni nesil dizileme teknolojisi, 2004 yılında 454 Life Sciences tarafından tanıtılmış, daha sonra Roche tarafından satın alınmıştır.[6]

Yeni nesil dizileme süreci; DNA / RNA'yı birden fazla parçaya ayırmayı, adaptörler eklemeyi, kitaplıkları dizilemeyi ve bir genomik dizi oluşturmak için yeniden birleştirmeyi içermektedir. Prensip olarak, kapiler elektroforeze benzemektedir. En önemli fark, yeni nesil dizilemenin milyonlarca parçayı büyük ölçüde paralel bir şekilde sıralaması ve sıralamanın maliyetini düşürürken hızı ve doğruluğu artırmasıdır.[7] Yeni nesil dizileme yöntemi, sentez yoluyla dizileme ve DNA zincirlerine dahil edildiklerinde tek bazların tanımlanmasını sağlayan tersinir sonlandırıcılara dayanmaktadır.[8]

Yeni nesil dizileme aşamaları

Akış hücresi
  1. Kütüphane hazırlığı: Kan örneğinden alınan genomik DNA (gDNA), ultrasonik kesme yolu ile uzunluğu 200-500 bp olan DNA parçası haline getirilmektedir. 5 ve 3’ adaptörleri DNA parçalarının her iki ucuna eklenmektedir. Adaptörle bağlanmış fragmanlar PCR ile çoğaltılıp jel ile saflaştırılmaktadır. Böylece sıralama kitaplığı oluşturulmaktadır.[8]
  2. Küme oluşturma: Akış hücresi, DNA parçalarını tutmak için üretilen cam sürgülü bir kanaldır. Tüm dizileme, akış hücresinde gerçekleşmektedir. Kütüphanedeki DNA fragmanları; akış hücresinin içinden geçtiklerinde, yüzey şeritlere rastgele bağlanmaktadır. Her şerit, oligonükleotit olarak da bilinen adaptörlere sahiptir. Oligonükleotitler, DNA parçasının uçlarına eklenen adaptörlerle eşleşmektedir. Eşleşmeden sonra DNA polimeraz ve nükleobazlar DNA fragmanına tutunarak, DNA fragmanının oligonükleotitlere göre tamamlanması sağlanmaktadır. Tamamlanan DNA fragmanları, oligonükleotitlerle köprü oluşturarak PCR yöntemiyle çoğaltılmaktadır. Köprü PCR işleminden sonra her bir DNA fragmanı, tek bir DNA şablonunun birçok kopyasını içeren ilgili konumlarında demetler halinde kümelenmektedir. Kümelenmenin amacı, bir araya gelen DNA fragmanlarının sinyal yoğunluğunu yükseltmektir.[8]
  3. Sıralama: Reaksiyon sistemine DNA polimeraz, bağlayıcı primerler ve baza özgü floresan işaretleyicilere sahip 4 adet nükleobaz eklenmektedir. Nükleobazların 3′-OH'si, sıralama işlemi sırasında bir seferde yalnızca bir bazın eklenmesini sağlayan kimyasal yöntemlerle korunmaktadır. Kullanılmayan tüm serbest nükleobaz ve DNA polimeraz, sentez reaksiyonu bittikten sonra ayrıştırılmaktadır. Daha sonra, floresan uyarımı için gerekli tampon çözeltisi eklenmektedir. Floresan sinyali lazerle uyarıldıktan sonra sinyal optik ekipmanla kaydedilmektedir. Optik sinyal bilgisayar analizi ile sıralama tabanına dönüştürülmektedir. Floresan sinyali kaydedildiğinde, sinyali söndürmek ve nükleobaz 3′-OH koruyucu grubunu çıkarmak için kimyasal bir reaktif eklenmektedir. Böylece, bir sonraki sıralama reaksiyonu gerçekleştirilebilmektedir.[8]
  4. Hizalama ve Veri Analizi: Tanımlanan dizi okumaları bir referans genoma hizalanmaktadır. Tek nükleotit polimorfizmi, ekle-sil tipi mutasyon, yapısal mutasyon, gen kopya sayısı; açıklama ve istatistikler, popülasyon genetiği analizi gibi birçok biyoenformatik analiz varyasyonu mümkündür.[8]

Kaynakça

  1. ^ Qin, Dahui (1 Şubat 2019). "Next-generation sequencing and its clinical application". Cancer Biology & Medicine. 16 (1): 4-10. doi:10.20892/j.issn.2095-3941.2018.0055. ISSN 2095-3941. PMC 6528456 $2. PMID 31119042. 27 Kasım 2021 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 23 Mayıs 2021. 
  2. ^ "Massive parallel sequencing". 23 Mayıs 2013 tarihinde kaynağından arşivlendi. 
  3. ^ Yohe, Sophia; Thyagarajan, Bharat (7 Ağustos 2017). "Review of Clinical Next-Generation Sequencing". Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (11): 1544-1557. doi:10.5858/arpa.2016-0501-RA. ISSN 0003-9985. 
  4. ^ "Generations of Sequencing Technologies: From First to Next Generation" (PDF). 27 Şubat 2019 tarihinde kaynağından (PDF) arşivlendi. 
  5. ^ Kulski, Jerzy (14 Ocak 2016). Next Generation Sequencing: Advances, Applications and Challenges (İngilizce). BoD – Books on Demand. ISBN 978-953-51-2240-1. 23 Mayıs 2021 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 23 Mayıs 2021. 
  6. ^ Alekseyev, Yuriy O.; Fazeli, Roghayeh; Yang, Shi; Basran, Raveen; Maher, Thomas; Miller, Nancy S.; Remick, Daniel (1 Ocak 2018). "A Next-Generation Sequencing Primer—How Does It Work and What Can It Do?". Academic Pathology (İngilizce). 5: 2374289518766521. doi:10.1177/2374289518766521. ISSN 2374-2895. PMC 5944141 $2. PMID 29761157. 
  7. ^ "How NGS Works". 2 Temmuz 2019 tarihinde kaynağından arşivlendi. 
  8. ^ a b c d e admin. "Principle and Workflow of Illumina Next-generation Sequencing | CD Genomics Blog" (İngilizce). 7 Ağustos 2020 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 23 Mayıs 2021. 

İlgili Araştırma Makaleleri

<span class="mw-page-title-main">Genetik</span> biyolojinin organizmalardaki kalıtım ve çeşitliliği inceleyen bir dalı

Genetik ya da kalıtım bilimi, biyolojinin organizmalardaki kalıtım ve genetik varyasyonu inceleyen bir dalıdır. Türkçeye Almancadan geçen genetik sözcüğü 1831 yılında Yunanca γενετικός - genetikos ("genitif") sözcüğünden türetildi. Bu sözcüğün kökeni ise γένεσις - genesis ("köken") sözcüğüne dayanmaktadır.

<span class="mw-page-title-main">DNA</span> Canlıların genetik bilgilerini barındıran molekül

Deoksiriboz nükleik asit veya kısaca DNA, tüm organizmaların ve bazı virüslerin canlılık işlevleri ve biyolojik gelişmeleri için gerekli olan genetik talimatları taşıyan bir nükleik asittir. DNA'nın başlıca rolü bilgiyi uzun süre saklamasıdır. Protein ve RNA gibi hücrenin diğer bileşenlerinin inşası için gerekli olan bilgileri içermesinden dolayı DNA; bir kalıp, şablon veya reçeteye benzetilir. Bu genetik bilgileri içeren DNA parçaları gen olarak adlandırılır. Bazı DNA dizilerinin yapısal işlevleri vardır, diğerleri ise bu genetik bilginin ne şekilde kullanılacağının düzenlenmesine yararlar.

<span class="mw-page-title-main">DNA replikasyonu</span> Biyolojik süreç

DNA replikasyonu veya DNA ikileşmesi, tüm organizmalarda meydana gelen ve DNA kopyalayarak kalıtımın temelini oluşturan biyolojik bir süreçtir. Süreç, bir adet çift iplikli DNA molekülüyle başlar ve iki özdeş DNA'nın oluşumuyla son bulur. Orijinal çift iplikli DNA'nın her ipliği, tamamlayıcı ipliğin üretiminde kalıp görevi görür. Hücresel proofreading ve hata kontrol mekanizmaları replikasyonun neredeyse hatasız gerçekleşmesini sağlar.

<span class="mw-page-title-main">İnsan Genom Projesi</span> İnsan genomu dizileme programı

İnsan Genom Projesi, insan DNA'sını oluşturan baz çiftlerini belirlemek, insan genomunun tüm genlerini fiziksel ve işlevsel açıdan tanımlamak ve gen haritasını çıkarmak amacını güden uluslararası bir bilimsel araştırma projesi. Farklı ülke ve kurumların iş birliğiyle yürütülen en büyük biyoloji projesidir. Projenin planlaması, 1984 yılında ABD hükûmeti tarafından kabul edildikten sonra başladı. Proje resmi olarak 1990'da başladı ve 14 Nisan 2003'te tamamlandığı duyuruldu. "Tam genom" düzeyi yalnızca Mayıs 2021'de GCA_00991475 derlemesinin üçüncü sürümünde arşivlendi.

Mutasyon ya da değişinim, bir canlının genomu içindeki DNA ya da RNA diziliminde meydana gelen kalıcı değişmelerdir. Mutasyona sahip bir organizma ise mutant olarak adlandırılır.

<span class="mw-page-title-main">Protein biyosentezi</span>

Protein biyosentezi, hücrenin protein sentezlenmesi için gereken bir biyokimyasal süreçtir. Bu terim bazen sadece protein translasyonu anlamında kullanılsa da transkripsiyon ile başlayıp translasyonla biten çok aşamalı bir süreçtir. Prokaryotlarda ve ökaryotlarda ribozom yapısı ve yardımcı proteinler bakımından farklılık göstermesine karşın, temel mekanizma korunmuştur.

<span class="mw-page-title-main">Elektroforez</span>

Elektroforez, bir elektrik alanın etkisi altında yüklü parçacıkların (iyonların) göçünü ve ayrılmasını tanımlayan genel bir terimdir. Bu teknoloji, nükleik asitlerin ayrıştırılması ve analizi için önem taşımaktadır. Nükleik asitlerin elektroforezi, klonlanmış DNA fragmanlarının izolasyonu ve manipülasyonu için laboratuvar tezgahında rutin olarak kullanılmaktadır. Ek olarak, nükleik asitlerin hücrelerdeki ve dokulardaki rolünü ve etkileşimini değerlendiren birçok moleküler biyoloji protokolünün kritik bir bileşenidir. Nükleik asit elektroforezi, mevcut genom dizileme çağında özel bir önem kazanmıştır. Bu uygulama, nükleik asit analizinin hızı ve doğruluğunu yansıtacak şekilde gelişmiştir.

<span class="mw-page-title-main">DNA onarımı</span> Hücresel mekanizma

DNA onarımı, DNA moleküllerindeki hataları onarım mekanizmalarını tanımlamaktadır. İnsan hücrelerinde metabolik aktiviteler ve çevresel faktörler sonucu günde 1 milyon hücrenin zarar görmesi olasıdır. Bu etkenler, DNA'nın yapısını ve dahası diğer nesillere aktarılan genetik bilgiyi değiştirebilirler. Bu değişimler yararlı olabileceği gibi, ölümcül sonuçlara neden olabilecek kadar da zararlı olabilir. Bu yüzden, bütün canlı hücreleri, evrim süreçleri boyunca nesillere değişmeden aktarılması gereken DNA molekülünü koruma mekanizmaları geliştirmişlerdir.

<span class="mw-page-title-main">DNA dizileme</span> moleküler biyolojide bir teknik

DNA dizilemesi, bir DNA molekülündeki nükleotit bazlarının sırasının belirlenmesidir.

<span class="mw-page-title-main">DNA polimeraz</span>

DNA polimeraz, DNA replikasyonunu sağlayan bir enzimdir. Bu enzimler bir DNA ipliğini kalıp olarak kullanır, onu okuyup, onun boyunca deoksiribonükleotitlerin polimerizasyonunu katalizler. Yeni polimerleşmiş molekül kalıp ipliği tamamlayıcıdır ve kalıp ipliğin eski eşi ile aynı yapıya sahiptir.

<span class="mw-page-title-main">Ters transkriptaz</span> RNA şablonundan DNA üreten bir enzim

Biyokimyada bir ters transkriptaz veya RNA'ya bağımlı DNA polimeraz, tek iplikli bir RNA molekülü okuyup tek iplikli DNA üreten bir DNA polimeraz enzimidir. Bu enzim, ayrıca, RNA tek iplikli cDNA şeklinde okunduktan sonra çift iplikli DNA oluşmasında da görev alır. Normal transkripsiyon DNA'dan RNA sentezidir; dolayısıyla ters transkripsiyon bu sürecin tersidir.

DNA profillemesi, insanların DNA profillerine dayanarak onların kimliklerinin tespitini kolaylaştırmak için forensik bilimcilerin kullandığı bir tekniktir. DNA profilleri, kişinin DNA'sına karşılık gelen şifrelenmiş numara dizileridir, bunlar kişinin kimlik belirteci olarak da kullanılabilir. DNA profillemesi tüm genom dizilemesi ile karıştırılmamalıdır.

Mikrosatelitler, Basit dizi tekrarları veya Kısa Bitişik Tekrarlar DNA'da bulunan, 1-6 baz çifti uzunluğundaki tekrar eden dizilerdir.

<span class="mw-page-title-main">Arkeogenetik</span>

Arkeogenetik, çeşitli moleküler genetik yöntemleri ve DNA kaynaklarını kullanarak antik DNA'yı inceleyen bir bilim dalıdır. Bu genetik analizler insan, hayvan ve bitki örnekleri üzerinde uygulanabilir. Antik DNA, kemikler, yumurta kabukları ve insan ile hayvan örneklerinde yapay olarak korunmuş dokular dahil olmak üzere çeşitli fosilleşmiş örneklerden elde edilebilir. Bitkilerde ise antik DNA, tohumlardan, dokulardan ve bazı durumlarda dışkıdan elde edilebilir. Arkeogenetik, eski nüfus grubu göçlerinin, evcilleştirmenin ve bitki ile hayvan evriminin genetik kanıtlarını sunar. Modern genetik popülasyonların DNA'sı ile antik DNA karşılaştırılabilir.

<span class="mw-page-title-main">Sanger dizilemesi</span>

Sanger dizilemesi, in vitro DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz tarafından zincir sonlandırıcı dideoksinükleotidlerin seçici bir şekilde dahil edilmesine dayanan bir DNA dizileme yöntemidir. İlk olarak 1977'de Frederick Sanger ve meslektaşları tarafından geliştirildikten sonra, yaklaşık 40 yıldır en yaygın kullanılan dizileme yöntemi haline geldi. İlk olarak 1986 yılında Applied Biosystems tarafından ticarileştirildi. Daha yakın zamanlarda, daha yüksek hacimli Sanger dizilemesi, özellikle büyük ölçekli, otomatik genom analizleri için "Gelecek-Nesil" dizileme yöntemleriyle değiştirildi. Bununla birlikte, Sanger yöntemi, daha küçük ölçekli projeler ve Gelecek-Nesil sonuçların doğrulanması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yine de, kısa okumalı dizileme teknolojilerine göre, >500 nükleotidlik DNA dizisi okumaları üretebilme avantajına sahiptir.

Alan hedefli mutajenez, bir genin DNA dizisinde ve herhangi bir gen ürününde spesifik ve kasıtlı değişiklikler yapmak için kullanılan bir moleküler biyoloji yöntemidir. Ayrıca alana özgü mutajenez veya oligonükleotide yönelik mutajenez olarak da adlandırılan bu, DNA, RNA ve protein moleküllerinin yapısını ve biyolojik aktivitesini araştırmak ve protein mühendisliği için kullanılır.

Oligonükleotitler, genetik test, araştırma ve adli tıpta geniş bir uygulama alanına sahip olan kısa DNA veya RNA molekülleri, oligomerleridir. Laboratuvarda katı faz kimyasal sentezi ile yaygın olarak yapılan bu küçük nükleik asit bitleri, herhangi bir kullanıcı tanımlı diziye sahip tek sarmallı moleküller olarak üretilebilir ve bu nedenle yapay gen sentezi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) DNA dizileme moleküler klonlama ve moleküler problar için hayati öneme sahiptir. Doğada oligonükleotitler genellikle gen ekspresyonunun düzenlenmesinde işlev gören küçük RNA molekülleri olarak bulunur veya daha büyük nükleik asit moleküllerinin parçalanmasından türetilen bozunma ara maddeleri olarak bulunur.

BRCA, meme ve yumurtalık kanseri yatkınlık genleri olarak bilinen ve 1990'lı yıllarda Mary-Claire King tarafından keşfedilen BRCA1 ve BRCA2 genleri meme ve yumurtalık kanseri ile ilgili DNA hasarının onarımında görevli tümör baskılayıcı genlerdir.

Moleküler patoloji, organlar, dokular veya vücut sıvıları içindeki genetik düzeydeki değişimlerin moleküler yöntemler aracılığıyla incelenmesi yoluyla hastalıkların araştırılmasına ve teşhisine odaklanan patoloji'nin yeni gelişmekte olan bir alt dalıdır Moleküler patoloji; tanıyı en uygun hale getirmek, tedaviyi ve hastalığın seyrini en iyi şekilde belirlemek için standart patolojik parametrelere ek olarak, genetik verilerin kullanımı olarak da tanımlanabilmektedir. Önemli bir husus, tanı hem dokulardaki morfolojik değişikliklere hem de moleküler testlere dayandığında daha hassas tanının mümkün olmasıdır.

<span class="mw-page-title-main">Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu</span>

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan bir moleküler biyoloji laboratuvar tekniğidir. Hedeflenen bir DNA molekülünün amplifikasyonunu geleneksel PCR'da olduğu gibi sonunda değil, PCR sırasında izler. Real-time PCR, kantitatif ve yarı-kantitatif olarak kullanılabilir.


Bu sayfa, bu Vikipedi makalesine dayanmaktadır.
Metin, CC BY-SA 4.0 lisansı altında mevcuttur; ek koşullar uygulanabilir.
Görseller, videolar ve sesler kendi lisansları altında mevcuttur.