İçeriğe atla

Streptavidin

Streptavidin tetramer, Streptomyces avidinii.

Streptavidin, Streptomyces avidinii'den elde edilen tetramerik (dört altbirimli) bir proteindir. Biotin-strepavidin kompleksinin ayrışma katsayısı (Kd) 10−14 mol/L mertebesindedir, bu bağlanma doğada bilinen en güçlü kovalent olmayan etkileşimlerden biridir. Streptavidin moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır, çünkü biotine olan olağanüstü afinitesinin yanı sıra, aşırı pH, sıcaklık, organik çözücüler, denaturanlar (guanidinium klorür gibi), deterjanlar (SDS, Triton gibi) ve proteolitik enzimler, bu proteinin biotine bağlanmasını etkilemez.

İşlevi

Streptavidin'in doğadaki işlevi bilinmemektedir.[1] Bu protein hücre dışına salgılandıktan sonra ortamdaki biotin moleküllerine bağlanıp onları başka mikroorganizmalar tarafından kullanılmaz hale getireceği için, streptavidinin bir antibiyotik görevine sahip olabileceği öne sürülmüştür.[2]

Yapısı

Streptavidin-biotin kompleksinin kristal yapısı Hendrickson ve arkadaşları tarafından 1989'da çözülmüştür.[3] 159 amino asit kalıntılı protein işlemlendikten sonra N- ve C- ucundan kırpılır, kalan protein 13-139. kalıntılardan ibarettir. Streptavidin monomerinin ikincil yapısı sekiz antiparalel beta (β) yapraktan oluşur, bunlar katlanıp bir antiparalel beta fıçı üçüncül yapı oluşturur. Her bir β fıçısının bir ucunda bir biotin bağlana yeri bulunur, bunların biotin için hem yüksek spesifitesi hem de yüksek afinitesi vardır. Dört tane birbirinin aynı streptavidin monomeri (yani dört birbirinin aynı β-fıçı) bir araya gelip streptavidinin tetramerik dördüncül yapısını oluşturur. Her fıçıdaki biotin bağlanıcı yer, fıçı içindeki kalıntılar ile, komşu bir altbirime ait bir Trp120'den oluşur. Böylece, her altbirim komşu altbirimin bağlanmasına katkıda bulunur. Dolayısıyla tetramerin aslında iki tane işlevsel dimerden oluştuğu düşünülebilir.

Biyoteknolojide kullanımı

Streptavidinin en yaygın kullanımları arasında çeşitli biyomoleküllerin saflaştırılması ve deteksiyonu vardır. Güçlü streptavidin-biotin bağı çeşitli biyomolekülleri birbirine veya katı bir yüzeye bağlamakta kullanılabilir. Proteinlerin saflaştırılması ve deteksiyonu için kullanılan Strep-tag bir diğer uygulamadır.

Başka bir yöntemde DNA önce bir restriksiyon enzimi ile sindirilir. Kesik DNA sonra E. coli DNA polimeraz I'in Klenow parçası ve biotin-11-dUTP (biotine kovalent bağlı bir deoksiribonükleotit analogu) ile inkübe edilir. Kesik DNA'nın 3' ucuna biotin-11-dUTP eklenir. Bunun nedeni DNA polimerazın DNA'nın 5'-fosfat ucuna değil sadece 3'-OH ucuna nükleotit ekleyebilmesidir.

  • 5'-ACTGGCTU-3'
  • 3'-TGACCGAACCGTT-5'

(burada U DNA'ya entegre olan biotin-11-UTP'dir)

dUTP eklemek için tek bir uç varsa, reaksiyonun ürünü bir ucu biotinleştirilmiş bir DNA ipliğidir. Biotinlenmiş DNA'nın başlıca kullanımlarından biri, DNA'yı streptavidin kaplı yüzeylere bağlamaktır. DNA sıkıca bu yüzeye bağlanınca, çeşitli DNA hibridizasyon ve immün testler yapılabilir. DNA ayrıca streptavidin kaplı agaroz mikrokürelere, polistiren ve hatta paramanyetik boncuklara de bağlanabilir. Bu kompleksler en yaygın olarak DNA'ya bağlanıcı proteinlerin saflaştırılması veya izolasyonunda kullanılır. Diğer moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak bu moleküler aracın dizisi, uzunluğu vb. kontrol edilebilir.

Monovalent ve monomerik streptavidin

Streptavidin bir tetramerdir ve her altbirim biotin'e aynı affinite ile bağlanır. Bazı uygulamalarda multivalent bağlanma bir avantajdır, örneğin streptavidine bağlı moleküllerin spesifik T-hücrelerine tespit etme yeteneğini artırır.[4] Başka durumlarda, örneğin hücre hücre içinde belli proteinlerin görüntülenmesi için streptavidin kullanılmasında, multivalentlik ilgi konusu olan proteinin işlevine bozabilir. Monovalent streptavidin, tetramerik streptavidinin genetik mühendislikle değiştirilmiş bir versiyonudur, dört bağlanma yerinden sadece biri işlevseldir.[5] Bu tek bağlanma yeri 10−14 düzeyinde bir affiniteye sahiptir ve çapraz bağlanmaya (cross linking) neden olmaz.

Monomerik streptavidin streptavidinin rekombinant bir biçimidir, tetramerin monomerlere ayrışmasına neden olan bir mutasyon içerir. Bu mutasyon ayrıca meydan gelen monomerlerin çözünürlüğünü artırır. Monomerik streptavidinin biotine olan afinitesi 10−7mol/L'dir ve bu yüzden işaretleme uygulamaları için ideal değildir, ama tersinirlik arzu ediliyorsa bu afinite değeri iyi bir özelliktir.[6]

Avidin ile kıyaslama

Streptavidin, biotine yüksek afinite ile bağlanan tek protein değildir. Biotine bağlanıcı proteinler arasında en kayda değer olanı avidindir. Bu protein evrimsel olarak streptavidinle ilişkili olmasa da çok benzer özelliklere sahiptir. Yumurta beyazından elde edilmiş olan avidinin streptavidin ile %30 dizi benzerliği vardır ama ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıları neredeyse aynıdır. Biotine olan afinitesi daha yüksektir (Kd ~ 10−15M) ama streptavidinden farklı olarak glikoziledir, pozitif yüklüdür, psödo-katalitik aktivitesi vardır (biotin ile bir nitrofenil grubu arasındaki bir ester bağının alkalin hidrolizini hızlandırabilir) ve öbekleşme (agregasyon) eğilimi daha yüksektir.

Streptavidinin izoelektrik noktası (pI) ~5 ile hafif asidiktir ama yaklaşık nötür pI'ye sahip bir rekombinant biçimi ticari olarak elde edilebilir. Streptavidinde bir karbonhidrat modifikasyonu olmaması ve neredeyse nötür bir pI'ye sahip olması nedeniyle avidine kıyasla çok daha düşük nonspesifik bağlanma gösterir. Deglikosile edilmiş avidin, büyüklüğü, pI ve nonspesifik özellikleri ile streptavidine benzer.

Kaynakça

  1. ^ "Streptavidin precursor". Uniprot. 18 Nisan 2016 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 4 Şubat 2011. 
  2. ^ United States. Dept. of Energy, National Research Council (U.S.) (1998). Serving science and society in the new millennium. National Academies Press. s. 21. ISBN 9780309062497. 
  3. ^ Hendrickson, W.A., Pahler, A., Smith, J.L., Satow, Y., Merrit, E.A. and Phizackerley, R.P. 1989. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. PNAS 86 (7) pp 2190 – 2194
  4. ^ MHC/peptide tetramer-based studies of T cell function. Xu XN, Screaton GR. J Immunol Methods. 2002 Oct 1;268(1):21-8. Review. PMID 12213339
  5. ^ A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Howarth M, Chinnapen DJ, Gerrow K, Dorrestein PC, Grandy MR, Kelleher NL, El-Husseini A, Ting AY. Nat Methods. 2006 Apr;3(4):267-73. pmid 16554831
  6. ^ Engineering soluble monomeric streptavidin with reversible biotin binding capability. Wu SC, Wong SL. J Biol Chem. 2005 Jun 17;280(24):23225-31. Epub 2005 Apr 19. PMID 15840576
  • Wilchek, M. and Bayer, E.A. (1989). Protein Recognition of Immobilized Ligands. Hutchins, T.W., ed. Alan R. Liss, Inc., pp. 83–90.
  • Current Protocols in Protein Science (1998) 9.7-9.7.13
  • Zimmermann R, Cox E (1994). "DNA stretching on functionalized gold surfaces". Nucleic Acids Res. 22 (3): 492-7. doi:10.1093/nar/22.3.492. PMID 8127690. 

Dış bağlantılar

İlgili Araştırma Makaleleri

<span class="mw-page-title-main">Biyoloji</span> canlıları inceleyen bilim dalı

Biyoloji ya da dirim bilimi, yaşamın bilimsel olarak incelenmesidir. Geniş bir kapsama sahip bir doğa bilimidir ancak onu tek ve tutarlı bir alan olarak birbirine bağlayan birkaç birleştirici teması vardır. Örneğin, tüm organizmalar, gelecek nesillere aktarılabilen genlerde kodlanmış kalıtsal bilgileri işleyen hücrelerden oluşur. Bir diğer ana tema ise yaşamın birliğini ve çeşitliliğini açıklayan evrimdir. Enerji işleme, organizmaların hareket etmesine, büyümesine ve çoğalmasına izin verdiği için yaşam için de önemlidir. Son olarak, tüm organizmalar kendi iç ortamlarını düzenleyebilmektedir.

<span class="mw-page-title-main">Protein</span> polipeptitlerin işlevsellik kazanması sonucu oluşan canlıların temel yapı birimi

Proteinler, bir veya daha fazla uzun amino asit artık zincirini içeren büyük biyomoleküller ve makromolekül'lerdir. Proteinler organizmalar içinde, hücrelere yapı ve organizmalar sağlayarak ve molekülleri bir konumdan diğerine taşıyarak metabolik reaksiyonları katalizleme, DNA kopyalama, uyaranlara yanıt verme dahil olmak üzere çok çeşitli işlevler gerçekleştirir. Proteinler, genlerinin nükleotit dizisi tarafından dikte edilen ve genellikle faaliyetini belirleyen özel 3D yapıya protein katlanmasıyla sonuçlanan amino asit dizilimlerinde birbirlerinden farklıdır.

<span class="mw-page-title-main">DNA</span> Canlıların genetik bilgilerini barındıran molekül

Deoksiriboz nükleik asit veya kısaca DNA, tüm organizmaların ve bazı virüslerin canlılık işlevleri ve biyolojik gelişmeleri için gerekli olan genetik talimatları taşıyan bir nükleik asittir. DNA'nın başlıca rolü bilgiyi uzun süre saklamasıdır. Protein ve RNA gibi hücrenin diğer bileşenlerinin inşası için gerekli olan bilgileri içermesinden dolayı DNA; bir kalıp, şablon veya reçeteye benzetilir. Bu genetik bilgileri içeren DNA parçaları gen olarak adlandırılır. Bazı DNA dizilerinin yapısal işlevleri vardır, diğerleri ise bu genetik bilginin ne şekilde kullanılacağının düzenlenmesine yararlar.

<span class="mw-page-title-main">DNA replikasyonu</span> Biyolojik süreç

DNA replikasyonu veya DNA ikileşmesi, tüm organizmalarda meydana gelen ve DNA kopyalayarak kalıtımın temelini oluşturan biyolojik bir süreçtir. Süreç, bir adet çift iplikli DNA molekülüyle başlar ve iki özdeş DNA'nın oluşumuyla son bulur. Orijinal çift iplikli DNA'nın her ipliği, tamamlayıcı ipliğin üretiminde kalıp görevi görür. Hücresel proofreading ve hata kontrol mekanizmaları replikasyonun neredeyse hatasız gerçekleşmesini sağlar.

<span class="mw-page-title-main">Ribozomal RNA</span> Ribozomun RNA bileşeni

Ribozomal RNA (rRNA), ribozomlarda bulunan bir RNA tipidir, ribozomun protein senteziyle ilişkili katalitik fonksiyonundan sorumludur. Ribozomal RNA'nın görevi, mRNA'daki bilginin translasyon süreci sırasında amino asit dizisine çevrilmesi için taşıyıcı RNA (tRNA) ile etkileşmek ve uzayan peptit zincirine amino asit takmaktır. Hücre sitoplazmasında serbest halde bulunan RNA'nın %80'i rRNA'dan oluşur.

<span class="mw-page-title-main">Enzim</span> biyomoleküller

Enzimler, kataliz yapan biyomoleküllerdir. Neredeyse tüm enzimler protein yapılıdır. Enzim tepkimelerinde, bu sürece giren moleküllere substrat denir ve enzim bunları farklı moleküllere, ürünlere dönüştürür. Bir canlı hücredeki tepkimelerin neredeyse tamamı yeterince hızlı olabilmek için enzimlere gerek duyar. Enzimler substratları için son derece seçici oldukları için ve pek çok olası tepkimeden sadece birkaçını hızlandırdıklarından dolayı, bir hücredeki enzimlerin kümesi o hücrede hangi metabolik yolakların bulunduğunu belirler.

<span class="mw-page-title-main">Transkripsiyon (genetik)</span> bir DNA parçasının RNAya kopyalanması süreci

Transkripsiyon, yazılma veya yazılım, DNA'yı oluşturan nükleotit dizisinin RNA polimeraz enzimi tarafından bir RNA dizisi olarak kopyalanması sürecidir. Başka bir deyişle, DNA'dan RNA'ya genetik bilginin aktarımıdır. Protein kodlayan DNA durumunda, transkripsiyon, DNA'da bulunan genetik bilginin bir protein veya peptit dizisine çevirisinin ilk aşamasıdır. RNA'ya yazılan bir DNA parçasına "transkripsiyon birimi" denir. Transkripsiyonda hata kontrol mekanizmaları vardır, ama bunlar DNA çoğalmasındakinden daha az sayıda ve etkindirler; dolayısıyla transkripsiyon DNA çoğalması kadar aslına sadık değildir.

RNA polimerazlar, bir DNA veya RNA molekülündeki bilgiyi RNA molekülü olarak kopyalayan bir enzimler ailesidir. Bir gende yer alan bilginin RNA molekülü olarak kopyalanma işlemi transkripsiyon olarak adlandırılır. Hücrelerde RNAP genlerin RNA zincirleri halinde okunmasını sağlar. RNA polimeraz enzimleri, tüm canlılarda ve çoğu virüste bulunur. Kimyasal bir deyişle, RNAP, bir nükleotidil transferaz enzimidir, bir RNA molekülünün üç ucunda ribonükleotitlerin polimerleşmesini sağlar.

Moleküler biyolojide bir transkripsiyon faktörü genlerin transkripsiyonunu düzenlemek için DNA üzerinde belli bir diziye bağlanabilen bir proteindir. Bunlar diziye-özgün DNA bağlanma proteini olarak da adlandırılır. Transkripsiyon faktörleri tek başına veya bir komplekste yer alan başka proteinlerle beraber, RNA polimeraz tarafından bir genin transkripsiyonunu ya kolaylaştırırlar veya engeller.

<span class="mw-page-title-main">Karbonik anhidraz</span>

Karbonik Anhidraz ya da karbonik dehidrataz, aktif bölgesinde çinko (Zn2+) iyonu içeren bir metaloenzim ailesidir ve yavaş bir reaksiyon olan karbondioksitin bikarbonat ve protona dönüşümünü katalizler. Karbonik anhidraz bu reaksiyonun hızını ileri derecede artırarak saniyede 104 – 106 reaksiyon hızına ulaştırır. Kırmızı kan hücrelerinde, hayvanların diğer kısımlarında ve bitkilerde bulunan, karbonik asidi karbondioksit ve suyla parçalayan enzim.

<span class="mw-page-title-main">Homolog rekombinasyon</span>

Homolog rekombinasyon, benzer veya aynı dizilere sahip DNA iplikleri arasında nükleotit dizilerinin birbiriyle yer değiştirdiği bir genetik rekombinasyon tipidir. Bu süreç sırasında DNA birkaç kere kesilir, sonra da birleştirilir. Homolog rekombinasyon, DNA'daki çift iplikli kırıkların hatasız tamirinde kullanılmanın yanı sıra, mayoz sırasında krosover yoluyla yeni DNA dizi bileşimlerinin (kombinezonlarının) oluşumunu da sağlar. DNA'daki yeni bileşimler genetik varyasyonlar oluşturur. Genetik varyasyonlar yeni, bir olasılıkla yararlı olabilecek alel kombinasyonlarıdır, bunların üreyen canlı topluluklarda oluşmaları, bu değişiklikleri taşıyan bireylerin değişen çevresel şartlara evrimsel adaptasyon göstermelerini sağlar.

<span class="mw-page-title-main">Alfa sarmal</span>

Protein ikincil yapısında yaygın bir motif olan alfa sarmal (α-sarmal), sağ-elli burgulu bir biçimdir, omurgadaki her bir N-H grubu, kendinden dört amino asit kalıntısı gerideki omurgadaki C=O grubuna bir hidrojen bağı verir. Bu ikincil yapı bazen klasik Pauling-Corey-Branson alfa sarmalı olarak da adlandırılır. Proteinlerin lokal yapı tipleri arasında α-sarmal, en düzenli olan, diziden öngörüsü yapılması en kolay olan ve ayrıca en yaygın olandır.

<span class="mw-page-title-main">Beta yaprak</span>

Proteinlerin ikincil yapısında β yaprak, alfa sarmaldan sonra en sık görülen biçimdir. Beta yapraklar birbirine en az iki veya üç hidrojen bağı ile yatay bağlanmış beta ipliklerden oluşur, bunlardan plili ve burkulmuş bir yaprak meydana getirir. Bir beta iplik 3 ila 10 amino asit uzunluğunda bir polipeptit zincirinden oluşur, polipeptir omurga neredeyse tamamen uzanık bir konformasyondadır. β yaprakların birleşmesinden kaynaklanan protein yığışımları (agregatlar) ve telcikler (fibriller), çeşitli hastalıkların oluşumunda rol oynar, bunların arasında Alzheimer gibi amiloidoz hastalıkları kayda değerdir.

Biyomoleküler yapı biyomoleküllerin yapısıdır. Bu moleküllerin yapısı genelde birincil, ikincil, üçüncül ve dördüncül yapı olarak ayrılır. Bu yapının iskeleti, molekül içinde birbirine hidrojen bağları ile bağlanmış ikincil yapı elemanları tarafından oluşturulur. Bunun sonucunda protein ve nükleik asit yapı bölgeleri oluşur.

Proteinler her organizmada bulunan önemli bir makromolekül sınıfıdır. Proteinler, 20 farklı tip L-α-amino asitten meydana gelen polimerlerdir. Amino asitler birbiriyle reaksiyona girdikten sonra meydana gelen polimerde bu amino asitlerden arta kalan birimlere amino asit kalıntısı denir. 40 kalıntıdan daha kısa olan zincirler için protein yerine genelde peptit terimi kullanılır. Biyolojik fonksiyonlarını yerine getirebilmek için proteinler uzay içinde belli bir biçim alacak şekilde katlanırlar. Bu katlanmayı yönlendiren güçler, protein atomları arasındaki hidrojen bağı, iyonik etkileşimler, van der Waals kuvvetleri ve hidrofobik istiflenme gibi, kovalent olmayan etkleşimlerdir. Proteinlerin işlevlerini moleküler düzeyde anlayabilmek için genelde onları üç boyutlu yapısının çözülmesi gerekir. Protein yapısını çözmek için X-ışını kristalografisi ve NMR spektroskopisi kullanılır, bunlar yapısal biyolojinin başlıca yöntemleri arasında yer alır.

Protein saflaştırması, karmaşık bir karışımdan tek bir tip proteini izole etmek için izlenen bir seri süreçtir. İlgi duyulan bir proteinin işlevi, yapısı ve diğer proteinlerle etkileşiminin karakterizasyonu için protein saflaştırması şarttır. Başlangıç malzemesi genelde bir biyolojik doku veya mikrobiyal kültürdür. Saflaştırma sürecinin çeşitli adımları sonucunda, protein içinde hapsolduğu ortamdan kurtarılır, karışımda bulunan protein olan ve protein olmayan kısımlar birbirinden ayrılır ve nihayet arzulanan protein tüm diğer proteinlerden ayrıştırılır. Bir proteinin diğer tüm proteinlerden ayrıştırmak, protein saflaştırmasının en zahmetli yanıdır. Ayrıştırma adımlarında proteinlerdeki büyüklük, fizikokimyasal özellikler, bağlanma afinitesi ve biyolojik etkinlik gibi unsurlardaki farklılıklardan yararlanılır.

<span class="mw-page-title-main">Protein birincil yapısı</span>

Peptit ve proteinlerin birincil yapısı, bu moleküllerin yapı birimleri olan amino asitlerin doğrusal sırası veya daha genel olarak, bir proteini oluşturan atomlar arasındaki kovalent bağların spesifikasyonudur.

Polihistidin etiketi genellikle proteinlerin N- veya C- sonunda bulunan, en az 6 histidin (His) amino asidinden meydana gelen bir amino asit motifi. Aynı zamanda hekza histidin etiketi, 6xHis etiketi, His6 etiketi ve marka ismiyle His etiketi olarak bilinir. Etiket Roche tarafından icat edilmiş olmasına rağmen Histidinlerin kullanımı ve vektörlerinin dağıtımı Qiagen tarafından gerçekleştirilir. Qiagen, Sigma, Thermo Scientific, GE Healthcare, Macherey-Nagel, Clontech, Bio-Rad ve diğer şirketler çeşitli histidin-etiketli protein saflaştırma kitlerini edinmeyi mümkün kılar. Etiketin bilimsel amaçlı kullanımı sınırsız iken ticari kullanıcılar Roche' ye telif hakkı ödemesi yapmak zorundadır. Orijinal patent 11 Şubat 2003' te sona erdi. Bundan dolayı şimdi kamu malı olarak ele alınmalıdır. Bazı etiket dizilerinin serbest ticari kullanımı serbesttir. Örneğin; MK(HQ)6 E. coli de güçlendirilmiş anlatımda ve etiket kaldırılmasında kullanılabilir. Etiketteki toplam His sayısı değişebilir. N- veya C-terminal his-etiketleri polihistidin etiketinin -endopeptidazlar tarafından- kaldırılmasını kolaylaştıracak müsait amino asit dizilerinin öncesinde veya sonrasında yer alabilir. Bu fazladan diziler His etiketi N-terminalden, ekzopeptidaz kullanımı ile, kaldırıldığında önem ifade etmezler. Bunun da ötesinde, endoproteaz temelli etiket kaldırılma yönteminin kullanımında spesifik olmayan kesimlere ortaya çıkar. Ekzopeptidazlar bu sorunun ortadan kalkmasına sağlayabilir. Polihistidin-etiketler genellikle genetik olarak değiştirilmiş olan proteinler ve afinite saflaştırması için tercih edilir.

Alan hedefli mutajenez, bir genin DNA dizisinde ve herhangi bir gen ürününde spesifik ve kasıtlı değişiklikler yapmak için kullanılan bir moleküler biyoloji yöntemidir. Ayrıca alana özgü mutajenez veya oligonükleotide yönelik mutajenez olarak da adlandırılan bu, DNA, RNA ve protein moleküllerinin yapısını ve biyolojik aktivitesini araştırmak ve protein mühendisliği için kullanılır.

Biyosentez, substratların canlı organizmalarda daha karmaşık ürünlere dönüştürüldüğü çok aşamalı, enzim katalizli bir süreçtir. Biyosentezde basit bileşikler modifiye edilir, diğer bileşiklere dönüştürülür veya makromoleküller oluşturmak üzere birleştirilir. Bu süreç genellikle metabolik yollardan oluşur. Bu biyosentetik yollardan bazıları tek bir hücresel organel içinde yer alırken diğerleri birden fazla hücresel organel içinde yer alan enzimleri içerir. Bu biyosentetik yolların örnekleri arasında çift katlı lipit katmanının bileşenlerinin ve nükleotidlerin üretimi yer alır. Biyosentez genellikle anabolizma ile eş anlamlıdır ve bazı durumlarda birbirinin yerine kullanılır.


Bu sayfa, bu Vikipedi makalesine dayanmaktadır.
Metin, CC BY-SA 4.0 lisansı altında mevcuttur; ek koşullar uygulanabilir.
Görseller, videolar ve sesler kendi lisansları altında mevcuttur.