İçeriğe atla

Sanger dizilemesi

Sanger dizilemesi, in vitro DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz tarafından zincir sonlandırıcı dideoksinükleotidlerin seçici bir şekilde dahil edilmesine dayanan bir DNA dizileme yöntemidir.[1][2] İlk olarak 1977'de Frederick Sanger ve meslektaşları tarafından geliştirildikten sonra, yaklaşık 40 yıldır en yaygın kullanılan dizileme yöntemi haline geldi. İlk olarak 1986 yılında Applied Biosystems tarafından ticarileştirildi.[3] Daha yakın zamanlarda, daha yüksek hacimli Sanger dizilemesi, özellikle büyük ölçekli, otomatik genom analizleri için "Gelecek-Nesil" dizileme yöntemleriyle değiştirildi. Bununla birlikte, Sanger yöntemi, daha küçük ölçekli projeler ve Gelecek-Nesil sonuçların doğrulanması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yine de, kısa okumalı dizileme teknolojilerine (Illumina gibi) göre, >500 nükleotidlik DNA dizisi okumaları üretebilme avantajına sahiptir.

DNA dizilemesi için Sanger (zincir-sonlandırma) yöntemi

Yöntem

Floresan ddNTP molekülleri

Klasik zincir sonlandırma yöntemi, tek sarmallı bir DNA şablonu, bir DNA primeri, bir DNA polimeraz, normal deoksinükleotidtrifosfatlar (dNTPs) ve modifiye di-deoksinükleotidtrifosfatlar (ddNTPs) gerektirir, bunlardan ikincisi DNA sarmalının uzamasını sonlandırır. Bu zincir sonlandırıcı nükleotidler, iki nükleotid arasında bir fosfodiester bağının oluşumu için gerekli olan bir 3'-OH grubundan yoksundur, bu da DNA polimerazın, modifiye bir ddNTP dahil edildiğinde DNA'nın uzamasını durdurmasına neden olur. DdNTP'ler, otomatik dizileme makinelerinde tespit için radyoaktif olarak veya floresan olarak etiketlenebilir.

DNA örneği, standart deoksinükleotidlerin dördünü (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP) ve DNA polimerazı içeren dört ayrı dizileme reaksiyonuna bölünmüştür. Her reaksiyona dört dideoksinükleotidden (ddATP, ddGTP, ddCTP veya ddTTP) sadece biri eklenirken, eklenen diğer nükleotidler sıradan olanlardır. Tam diziyi hala kopyalarken yeterli fragmanın üretilmesine izin vermek için deoksinükleotid konsantrasyonu (örn. 0,5 mM dTTP: 0,005 mM ddTTP), karşılık gelen dideoksinükleotidinkinden yaklaşık 100 kat daha yüksek olmalıdır (ancak ddNTP konsantrasyonu aynı zamanda istenen dizi uzunluğuna da bağlıdır).[2] Daha mantıklı bir sıraya koyarsak, bu süreçte dört ddNTP'nin tümünü test etmek için dört ayrı reaksiyona ihtiyaç vardır. Bağlı primerden şablon DNA uzatma turlarının ardından, elde edilen DNA fragmanları ısıyla denatüre edilir ve jel elektroforezi kullanılarak boyuta göre ayrılır. 1977 tarihli orijinal yayında,[2] baz çiftli ssDNA döngülerinin oluşumu, bazı yerlerde bantları çözmede ciddi zorlukların bir sebebiydi. Bu sıklıkla denatüre edici bir poliakrilamid-üre jeli kullanılarak gerçekleştirilir ve dört reaksiyonun her biri dört ayrı şeritten birinde (A, T, G, C şeritleri) yürütülür. DNA bantları daha sonra otoradyografi veya UV ışığı ile görselleştirilebilir ve DNA dizisi doğrudan X-ışını filmi veya jel görüntüsünden okunabilir.

Radyoaktif olarak etiketlenmiş dizileme jelinin parçası

Sağdaki görüntüde, X-ışını filmi jele maruz bırakıldı ve koyu bantlar, farklı uzunluklardaki DNA fragmanlarına karşılık geliyor. Bir şeritteki koyu bir bant, bir dideoksinükleotidin (ddATP, ddGTP, ddCTP veya ddTTP) dahil edilmesinden sonra zincir sonlandırmasının sonucu olan bir DNA parçasını belirtir. Aşağıdan yukarıya dört şerit arasındaki farklı bantların göreceli konumları daha sonra DNA dizisini okumak için kullanılır.

DNA fragmanları, primer (1) üzerinde radyoaktif veya floresan bir etiketle, yeni DNA zincirinde etiketli bir dNTP ile veya etiketli bir ddNTP ile etiketlenir.

Zincir sonlandırma dizilemesinin teknik varyasyonları arasında radyoaktif etiketleme için radyoaktif fosfor içeren nükleotidlerle etiketleme veya 5'ucunda bir floresan boya ile etiketlenmiş bir primer kullanılması yer alır. Boya astar dizilemesi, daha hızlı ve daha ekonomik analiz ve otomasyon için optik bir sistemde okumayı kolaylaştırır. Leroy Hood ve floresan etiketli ddNTP'ler ve primerlerin iş arkadaşları[4][5] tarafından yapılan sonraki geliştirme, otomatikleştirilmiş, yüksek verimli DNA dizilimi için zemin hazırladı.

Floresan zirvelerine kıyasla radyoaktif dizileme ile dizileme merdiveni

Zincir sonlandırma yöntemleri, DNA dizilimini büyük ölçüde basitleştirmiştir. Örneğin, zincir sonlandırmaya dayalı kitler, dizileme için gerekli reaktifleri içeren, önceden bölünmüş ve kullanıma hazır olan ticari olarak mevcuttur. Sınırlamalar arasında primerin DNA'ya spesifik olmayan bağlanması, DNA dizisinin doğru okunmasını ve dizinin doğruluğunu etkileyen DNA sekonder yapıları bulunur.

Boya-sonlandırıcı dizilemesi

Kapiler elektroforez

Boya sonlandırıcı dizilemesi, etiketli primer yöntemindeki gibi dört reaksiyon yerine tek bir reaksiyonda dizilemeye izin veren zincir sonlandırıcı ddNTP'lerin etiketlemesini kullanır. Boya sonlandırıcı dizilemede, dört dideoksinükleotid zincir sonlandırıcıdan her biri, her biri farklı dalga boylarında ışık yayan floresan boyalarla etiketlenir.

Daha uygunluğu ve hızı sayesinde, boya sonlandırıcı dizileme artık otomatik dizilemede temel dayanaktır. Sınırlamaları, boya etiketli zincir sonlandırıcıların DNA fragmanına dahil edilmesindeki farklılıklardan kaynaklanan boya etkilerini içerir, bu da kılcal elektroforezden sonra elektronik DNA dizisi izleme kromatogramında eşit olmayan tepe yükseklikleri ve şekilleriyle sonuçlanır.

Bu sorun, "boya lekelerini" ortadan kaldırmak için yöntemlerin yanı sıra, dahil etme değişkenliğini en aza indiren modifiye edilmiş DNA polimeraz enzim sistemleri ve boyalarının kullanılmasıyla ele alınmıştır. Boya sonlandırıcı dizileme yöntemi, otomatik yüksek verimli DNA dizisi analizörleriyle birlikte, Gelecek-Nesil Dizileme'nin tanıtımına kadar dizileme projelerinin büyük çoğunluğunda kullanıldı.

Otomasyon ve örnek hazırlama

Örnek bir boya sonlandırıcının başlangıcının görünümü

Otomatik DNA dizileme cihazları (DNA sıralayıcılar), tek bir grupta 384'e kadar DNA örneğini sıralayabilir. Toplu çalıştırmalar günde 24 defaya kadar gerçekleşebilir. DNA sıralayıcıları kılcal elektroforez kullanarak şeritleri boyuta (veya uzunluğa) göre ayırır, boya floresansını tespit eder ve kaydeder ve flüoresan tepe izleme kromatogramları olarak çıktı verileri. Örnekleri sıralayıcıya yüklemeden önce, bir tampon solüsyonunda örneklerin dizileme reaksiyonları (ısıl döngü ve etiketleme), temizlenmesi ve yeniden süspansiyonu ayrı ayrı gerçekleştirilir. Bir dizi ticari ve ticari olmayan yazılım paketi, düşük kaliteli DNA izlerini otomatik olarak kesebilir. Bu programlar her zirvenin kalitesini puanlar ve düşük kaliteli temel zirveleri kaldırır (genellikle dizinin sonlarında bulunur). Bu tür algoritmaların doğruluğu, bir insan operatör tarafından yapılan görsel incelemeden daha düşüktür, ancak büyük sıralı veri setlerinin otomatik olarak işlenmesi için yeterlidir.

Zorluklar

Sanger yöntemiyle DNA dizilemesinin yaygın zorlukları, primer bağlanması nedeniyle dizinin ilk 15-40 bazında düşük kaliteyi ve 700-900 bazdan sonra dizileme izlerinin kalitesinin bozulmasını içerir. Phred gibi temel arama yazılımı, tipik olarak, dizilerin düşük kaliteli bölgelerinin kırpılmasına yardımcı olmak için bir kalite tahmini sağlar.[6][7]

DNA fragmanlarının dizilemeden önce klonlandığı durumlarda, ortaya çıkan dizi, klonlama vektörünün parçalarını içerebilir. Bunun aksine, PCR tabanlı klonlama ve piroz sıraya dayalı yeni nesil dizileme teknolojileri genellikle klonlama vektörlerini kullanmaktan kaçınır. Son zamanlarda, Ampliseq ve SeqSharp gibi tek adımlı Sanger dizileme (kombine amplifikasyon ve dizileme) yöntemleri, klonlama veya önceden amplifikasyon olmadan hedef genlerin hızlı dizilemesine izin veren geliştirilmiştir.[8][9]

Mevcut yöntemler, tek bir reaksiyonda yalnızca nispeten kısa (300-1000 nükleotid uzunluğunda) DNA parçalarını doğrudan sıralayabilir. Bu boyut sınırının üzerindeki DNA fragmanlarının sıralanmasının önündeki ana engel, uzunlukları sadece bir nükleotid kadar farklılık gösteren büyük DNA fragmanlarını çözmek için yetersiz ayırma gücüdür.

Mikroakışkan Sanger dizilemesi

Sanger dizileme adımlarının (termal döngü, örnek saflaştırma ve kapiler elektroforez) nanolitre ölçekli örnek hacimleri kullanılarak wafer-ölçekli bir çip üzerine entegre edildiği, DNA dizilemesi için bir çip üzerinde laboratuvar uygulamasıdır. Bu teknoloji, Sanger dizileme adımlarını entegre ederek ve otomatikleştirerek geleneksel Sanger yönteminin (örn. pahalı reaktiflerin yüksek tüketimi, pahalı ekipmanlara güvenme, personel yoğun manipülasyonlar, vb.) birçok önemli eksikliğini ortadan kaldırırken, uzun ve doğru dizi okumaları üretir.

Modern başlangıcında, yüksek verimli genom dizilimi, genomun küçük tek sarmallı parçalara bölünmesini ve ardından parçaların Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile amplifikasyonunu içerir. Sanger yöntemini benimseyen her DNA fragmanı, flüoresan olarak etiketlenmiş bir dideoksi zincirini sonlandıran nükleotidin dahil edilmesiyle geri döndürülemez bir şekilde sonlandırılır, böylece her biri uzunluğu bir baz ile farklılık gösteren ve terminal bazında baza özgü bir floresan etiket taşıyan bir DNA fragmanları üretir. Güçlendirilmiş baz merdivenleri daha sonra, parçaların sıralı bir dizisini sağlayan floresan etiketli ssDNA parçalarının otomatik, yerinde "bitiş çizgisi" tespiti ile Kapiler Dizi Elektroforezi ile ayrılır. Bu dizi okumaları daha sonra bilgisayar, tam olarak birleştirildikten sonra tam genomik diziye benzeyen üst üste binen veya bitişik dizilemeler ("contigs" olarak adlandırılır) halinde birleştirilir.[10]

Sanger yöntemleri, yaklaşık 800bp'lik okuma uzunluklarına ulaşır (tipik olarak zenginleştirilmemiş DNA ile 500-600bp). Sanger yöntemlerinde daha uzun okuma uzunlukları, diğer dizileme yöntemlerine göre, özellikle genomun tekrarlayan bölgelerinin dizilenmesi açısından önemli avantajlar sergilemektedir. Kısa okunan dizi verilerinin zorluğu, özellikle yeni genomların (de novo) dizilemesinde ve yüksek düzeyde yeniden düzenlenmiş genom bölümlerinin, tipik olarak kanser genomlarında veya yapısal varyasyon sergileyen kromozom bölgelerinde görülenlerin dizilemesinde bir sorundur.[11]

Mikroakışkan dizileme teknolojilerinin uygulamaları

DNA dizilemesinin diğer yararlı uygulamaları arasında tek nükleotid polimorfizm saptama, tek sarmallı konformasyon polimorfizm heterodubleks analizi ve kısa tandem tekrar analizi yer alır. DNA parçalarının boyut ve/veya konformasyon farklılıklarına göre çözümlenmesi, genomun bu özelliklerinin incelenmesinde en kritik adımdır.[10]

Cihaz tasarımı

Sıralama çipi, 100 mm çapında üç cam gofret ve bir polidimetilsiloksan membrandan oluşan dört katmanlı bir yapıya sahiptir. Reaksiyon odaları ve kapiler elektroforez kanalları, termal olarak bağlanmış en üstteki iki cam wafer (hangi cihaz öğelerinin mikrofabrike olduğu) arasında oyulmuştur. Üç boyutlu kanal ara bağlantıları ve mikrovalfler, PDMS ve alt manifold cam yonga plakası tarafından oluşturulur.

Cihaz, her biri Sanger dizileme adımlarına karşılık gelen üç işlevsel birimden oluşur. Termal-döngü ünitesi, entegre dirençli sıcaklık dedektörü, mikrovalfler ve bir yüzey ısıtıcısı olan 250 nanolitre reaksiyon odasıdır. Reaktifin en üstteki tüm cam katman ile alt cam-PDMS katmanı arasındaki hareketi, 500 µm çaplı geçiş delikleri aracılığıyla gerçekleşir. Termal-döngüden sonra, reaksiyon karışımı yakalama/saflaştırma bölmesinde saflaştırmaya tabi tutulur ve ardından kapiler elektroforez bölmesine enjekte edilir. CE ünitesi, 65 μm genişliğindeki dönüşlerle kompakt bir geri dönüş düzenine katlanan 30 cm'lik bir kapilerden oluşur.

Dizileme kimyası

Termal-döngü

Termal-döngü reaksiyon odasında, boya sonlandırıcı sekanslama reaktifi, şablon DNA ve primerler, termal-döngü odasına yüklenir ve 35 döngü boyunca termal döngü yapılır (95 °C'de 12 saniye ve 60 °C'de 55 saniye).

Arıtma

Yüklenen reaksiyon karışımı (uzatma parçaları, şablon DNA ve fazla dizileme reaktifi içerir), yakalama çıkışı ve giriş delikleri arasına uygulanan 33 Volt/cm'lik bir elektrik alanı aracılığıyla 30 °C'de bir yakalama/saflaştırma bölmesinden geçirilir. Örneğin sürüldüğü yakalama jeli, bir poliakrilamid matrisine kovalent olarak bağlanmış 40 μM oligonükleotidden (primerleri tamamlayıcı) oluşur. Uzatma fragmanları, jel matris ile hareketsizleştirilir ve fazla primer, şablon, serbest nükleotitler ve tuzlar, yakalama atık portu yoluyla elüte edilir. Yakalama jeli, uzatma parçalarını serbest bırakmak için 67-75 °C'ye ısıtılır.

Kapiler elektroforez

Uzatma fragmanları, 125-167-V/cm alan aracılığıyla elektroforeze tabi tutuldukları kapiler-elektrofez bölmesine enjekte edilir.

Platformlar

Apollo 100 platformu,[12] ilk iki Sanger sıralama adımını (termal-döngü ve arıtma) tam otomatik bir sistemde birleştirir. Üretici, örneklerin ve reaktiflerin sisteme yüklenmesinin ardından üç saat içinde kapiler elektroforez için hazır olduğunu iddia ediyor. Apollo 100 platformu, mikrolitre altı reaktif hacmi gerektirir.

Diğer dizileme teknikleriyle karşılaştırmalar

Sanger yöntemleri ve gelecek-nesil yöntemler dahil olmak üzere genom dizileme teknolojileri için performans değerleri[11][13][14]
Teknoloji Şerit sayısı Enjeksiyon hacmi (nL) Analiz süresi Ortalama okuma uzunluğu Çıktı (analiz dahil;Mb/sa ) Jel dökülmesi Şerit takibi
Döşeme jeli 96 500-1000 6-8 saat 700 bp 0,0672 Evet Evet
Kapiler dizi elektroforezi 96 1-5 1-3 saat 700 bp 0.166 Hayır Hayır
Mikroçip 96 0.1-0.5 6-30 dakika 430 bp 0.660 Hayır Hayır
454/Roche FLX (2008) <0.001 4 saat 200-300 bp 20-30
Illumina/Solexa (2008) 2-3 gün 30-100 bp 20
ABI/SOLiD (2008) 8 gün 35 bp 5-15
Illumina MiSeq (2019) 1-3 gün 2x75-2x300 bp 170-250
Illumina NovaSeq (2019) 1-2 gün 2x50-2x150 bp 22.000-67.000
Ion Torrent Ion 530 (2019) 2,5-4 saat 200-600 bp 110-920
BGI MGISEQ-T7 (2019) 1 gün 2x150 bp 250.000
Pacific Biosciences SMRT (2019) 10-20 saat 10–30 kb 1.300
Oxford Nanopore MinIon (2019) 3 gün 13–20 kb[15]700

Yüksek verimli dizilimin nihai amacı, düşük maliyetli ve uzun okuma uzunlukları elde etmede son derece verimli sistemler geliştirmektir. Her bir elektroforetik ayırmanın daha uzun okuma uzunlukları, de novo DNA dizilemesi ile ilişkili maliyeti ve belirli bir artıklıkta DNA bileşenlerini dizilemek için gereken şablon sayısını önemli ölçüde azaltır. Mikroakışkanlar daha hızlı, daha ucuz ve daha kolay dizi montajına izin verebilir.[10]

Kaynakça

  1. ^ Sanger F; Coulson AR (Mayıs 1975). "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase". J. Mol. Biol. 94 (3): 441-8. doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID 1100841. 
  2. ^ a b c Sanger F; Nicklen S; Coulson AR (Aralık 1977). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5463-7. Bibcode:1977PNAS...74.5463S. doi:10.1073/pnas.74.12.5463. PMC 431765 $2. PMID 271968. 
  3. ^ Adams, Jill U. (2008). "DNA Sequencing Technologies". Nature Education. 19 Ekim 2008 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 24 Ekim 2019. 
  4. ^ Smith LM; Sanders JZ; Kaiser RJ; Hughes, Peter; Dodd, Chris; Connell, Charles R.; Heiner, Cheryl; Kent, Stephen B. H.; Hood, Leroy E. (1986). "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis". Nature. 321 (6071): 674-9. Bibcode:1986Natur.321..674S. doi:10.1038/321674a0. PMID 3713851. 
  5. ^ Smith LM; Fung S; Hunkapiller MW; Hunkapiller TJ; Hood LE (Nisan 1985). "The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at the 5' terminus: synthesis of fluorescent DNA primers for use in DNA sequence analysis". Nucleic Acids Res. 13 (7): 2399-412. doi:10.1093/nar/13.7.2399. PMC 341163 $2. PMID 4000959. 
  6. ^ "Phred - Quality Base Calling". 15 Aralık 2001 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 24 Şubat 2011. 
  7. ^ Ledergerber, C; Dessimoz, C (2011). "Base-calling for next-generation sequencing platforms". Briefings in Bioinformatics. 12 (5): 489-97. doi:10.1093/bib/bbq077. PMC 3178052 $2. PMID 21245079. 
  8. ^ Murphy, K.; Berg, K.; Eshleman, J. (2005). "Sequencing of genomic DNA by combined amplification and cycle sequencing reaction". Clinical Chemistry. 51 (1): 35-39. doi:10.1373/clinchem.2004.039164. PMID 15514094. 
  9. ^ Sengupta, D. .; Cookson, B. . (2010). "SeqSharp: A general approach for improving cycle-sequencing that facilitates a robust one-step combined amplification and sequencing method". The Journal of Molecular Diagnostics. 12 (3): 272-277. doi:10.2353/jmoldx.2010.090134. PMC 2860461 $2. PMID 20203000. 
  10. ^ a b c Kan, Cheuk-Wai; Fredlake, Christopher P.; Doherty, Erin A. S.; Barron, Annelise E. (1 Kasım 2004). "DNA sequencing and genotyping in miniaturized electrophoresis systems". Electrophoresis. 25 (21–22): 3564-3588. doi:10.1002/elps.200406161. PMID 15565709. 
  11. ^ a b Morozova, Olena; Marra, Marco A (2008). "Applications of next-generation sequencing technologies in functional genomics". Genomics. 92 (5): 255-64. doi:10.1016/j.ygeno.2008.07.001. PMID 18703132. 
  12. ^ Microchip Biologies Inc. Apollo 100 28 Ağustos 2008 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.
  13. ^ Sinville, Rondedrick; Soper, Steven A (2007). "High resolution DNA separations using microchip electrophoresis". Journal of Separation Science. 30 (11): 1714-28. doi:10.1002/jssc.200700150. PMID 17623451. 
  14. ^ Kumar, Kishore; Cowley, Mark; Davis, Ryan (2019). "Next-Generation Sequencing and Emerging Technologies". Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (7): 661-673. doi:10.1055/s-0039-1688446. ISSN 0094-6176. PMID 31096307. 
  15. ^ Tyson (2018). "MinION-based long-read sequencing and assembly extends the Caenorhabditis elegans reference genome". Genome Research. 28 (2): 266-274. doi:10.1101/gr.221184.117. ISSN 1088-9051. PMC 5793790 $2. PMID 29273626. 

İlgili Araştırma Makaleleri

<span class="mw-page-title-main">Genetik</span> biyolojinin organizmalardaki kalıtım ve çeşitliliği inceleyen bir dalı

Genetik ya da kalıtım bilimi, biyolojinin organizmalardaki kalıtım ve genetik varyasyonu inceleyen bir dalıdır. Türkçeye Almancadan geçen genetik sözcüğü 1831 yılında Yunanca γενετικός - genetikos ("genitif") sözcüğünden türetildi. Bu sözcüğün kökeni ise γένεσις - genesis ("köken") sözcüğüne dayanmaktadır.

<span class="mw-page-title-main">İnsan Genom Projesi</span> İnsan genomu dizileme programı

İnsan Genom Projesi, insan DNA'sını oluşturan baz çiftlerini belirlemek, insan genomunun tüm genlerini fiziksel ve işlevsel açıdan tanımlamak ve gen haritasını çıkarmak amacını güden uluslararası bir bilimsel araştırma projesi. Farklı ülke ve kurumların iş birliğiyle yürütülen en büyük biyoloji projesidir. Projenin planlaması, 1984 yılında ABD hükûmeti tarafından kabul edildikten sonra başladı. Proje resmi olarak 1990'da başladı ve 14 Nisan 2003'te tamamlandığı duyuruldu. "Tam genom" düzeyi yalnızca Mayıs 2021'de GCA_00991475 derlemesinin üçüncü sürümünde arşivlendi.

<span class="mw-page-title-main">Elektroforez</span>

Elektroforez, bir elektrik alanın etkisi altında yüklü parçacıkların (iyonların) göçünü ve ayrılmasını tanımlayan genel bir terimdir. Bu teknoloji, nükleik asitlerin ayrıştırılması ve analizi için önem taşımaktadır. Nükleik asitlerin elektroforezi, klonlanmış DNA fragmanlarının izolasyonu ve manipülasyonu için laboratuvar tezgahında rutin olarak kullanılmaktadır. Ek olarak, nükleik asitlerin hücrelerdeki ve dokulardaki rolünü ve etkileşimini değerlendiren birçok moleküler biyoloji protokolünün kritik bir bileşenidir. Nükleik asit elektroforezi, mevcut genom dizileme çağında özel bir önem kazanmıştır. Bu uygulama, nükleik asit analizinin hızı ve doğruluğunu yansıtacak şekilde gelişmiştir.

<span class="mw-page-title-main">DNA dizileme</span> moleküler biyolojide bir teknik

DNA dizilemesi, bir DNA molekülündeki nükleotit bazlarının sırasının belirlenmesidir.

RNA polimerazlar, bir DNA veya RNA molekülündeki bilgiyi RNA molekülü olarak kopyalayan bir enzimler ailesidir. Bir gende yer alan bilginin RNA molekülü olarak kopyalanma işlemi transkripsiyon olarak adlandırılır. Hücrelerde RNAP genlerin RNA zincirleri halinde okunmasını sağlar. RNA polimeraz enzimleri, tüm canlılarda ve çoğu virüste bulunur. Kimyasal bir deyişle, RNAP, bir nükleotidil transferaz enzimidir, bir RNA molekülünün üç ucunda ribonükleotitlerin polimerleşmesini sağlar.

Moleküler biyolojide bir baz çifti, birbirine ters doğrultuda iki DNA veya RNA zinciri üzerinde bulunan, biribirine hidrojen bağları ile bağlanmış iki nükleobazdır. Standart Watson-Crick baz eşleşmesinde, adenin (A), timin (T) ile, guanin de sitozin ile bir baz çifti oluşturur. RNA içinde olan baz çiftlerinde timin'in yerini urasil (U) alır. Watson-Crick tipi olmayan ve alternatif hidrojen bağlarıyla meydana gelmiş baz çiftleri de oluşabilir, özellikle RNA'da; bunlara Hoogsteen baz çiftlerinde de rastlanır.

<span class="mw-page-title-main">DNA polimeraz</span>

DNA polimeraz, DNA replikasyonunu sağlayan bir enzimdir. Bu enzimler bir DNA ipliğini kalıp olarak kullanır, onu okuyup, onun boyunca deoksiribonükleotitlerin polimerizasyonunu katalizler. Yeni polimerleşmiş molekül kalıp ipliği tamamlayıcıdır ve kalıp ipliğin eski eşi ile aynı yapıya sahiptir.

DNA denatürasyonu, iki iplikçikli DNA'nın bazları arasındaki hidrojen bağlarının kırılması sonucu, çözülüp, iplikçiklerinin birbirinden ayrılması sürecidir. Her iki terim de, çözeltideki DNA'nın ısıtılması sonucu iplikçiklerin ayrılması için kullanılır ancak denatürsayon, üre gibi kimyasallar tarafından da meydana gelebilir. Çok sayıda DNA molekülünden söz edilirken, ergime sıcaklığı (Tm), DNA iplikçiklerinin yarısının ikili sarmal, yarısının ise rastgele sarım hâlinde olduğu sıcaklıktır. Ergime sıcaklığı, molekülün uzunluğuna ve onun nükleotit bileşimine bağlıdır.

Kimyada metilasyon veya metillenme, bir kimyasal bileşiğe bir metil grubunun bağlanması veya sübstitüsyonudur. Bu terim kimyada, biyokimyada, toprak bilimlerinde ve hayat bilimlerinde yaygınca kullanılır.

<span class="mw-page-title-main">İnsan genomu</span>

İnsan genomu Homo sapiens'in genomudur. 23 kromozom çifti üzerinde bulunur, bunlardan 22 çifti otozomal kromozomdur, kalan çift ise cinsiyeti belirler. Haploit insan genomu toplam 3 milyar DNA baz çiftinden biraz fazla uzunluktadır. İnsan Genom Projesi ile elde edilen ökromatik insan genom referans dizisi biyomedikal bilimlerde kullanılmaktadır.

DNA profillemesi, insanların DNA profillerine dayanarak onların kimliklerinin tespitini kolaylaştırmak için forensik bilimcilerin kullandığı bir tekniktir. DNA profilleri, kişinin DNA'sına karşılık gelen şifrelenmiş numara dizileridir, bunlar kişinin kimlik belirteci olarak da kullanılabilir. DNA profillemesi tüm genom dizilemesi ile karıştırılmamalıdır.

Mikrosatelitler, Basit dizi tekrarları veya Kısa Bitişik Tekrarlar DNA'da bulunan, 1-6 baz çifti uzunluğundaki tekrar eden dizilerdir.

Moleküler evrim, nesiller boyu aktarılacak şekilde, DNA, RNA ve protein gibi hücresel moleküllerin diziliminin değiştirilmesi işlemidir ya da bununla ilgilenen bilim dalıdır. Moleküler evrimin alanı, bu değişimlerdeki kalıpları açıklamak için evrimsel biyoloji ve popülasyon genetiği ilkelerini kullanır. Moleküler evrim başlıca, nükleotid değişimlerinin oranları ve etkilerini, nötr evrimi, doğal seçilimi, yeni genlerin kökenlerini, karmaşık özelliklerin genetik yapısını, türleşmenin genetik temelini, gelişim evrimini ve evrimin genomik ve fenotipik değişikliklere neden olan etkilerini inceler.

<span class="mw-page-title-main">Arkeogenetik</span>

Arkeogenetik, çeşitli moleküler genetik yöntemleri ve DNA kaynaklarını kullanarak antik DNA'yı inceleyen bir bilim dalıdır. Bu genetik analizler insan, hayvan ve bitki örnekleri üzerinde uygulanabilir. Antik DNA, kemikler, yumurta kabukları ve insan ile hayvan örneklerinde yapay olarak korunmuş dokular dahil olmak üzere çeşitli fosilleşmiş örneklerden elde edilebilir. Bitkilerde ise antik DNA, tohumlardan, dokulardan ve bazı durumlarda dışkıdan elde edilebilir. Arkeogenetik, eski nüfus grubu göçlerinin, evcilleştirmenin ve bitki ile hayvan evriminin genetik kanıtlarını sunar. Modern genetik popülasyonların DNA'sı ile antik DNA karşılaştırılabilir.

Alan hedefli mutajenez, bir genin DNA dizisinde ve herhangi bir gen ürününde spesifik ve kasıtlı değişiklikler yapmak için kullanılan bir moleküler biyoloji yöntemidir. Ayrıca alana özgü mutajenez veya oligonükleotide yönelik mutajenez olarak da adlandırılan bu, DNA, RNA ve protein moleküllerinin yapısını ve biyolojik aktivitesini araştırmak ve protein mühendisliği için kullanılır.

BRCA, meme ve yumurtalık kanseri yatkınlık genleri olarak bilinen ve 1990'lı yıllarda Mary-Claire King tarafından keşfedilen BRCA1 ve BRCA2 genleri meme ve yumurtalık kanseri ile ilgili DNA hasarının onarımında görevli tümör baskılayıcı genlerdir.

Yeni nesil dizileme; DNA, RNA dizileme ve varyant / mutasyon tespiti için yeni bir teknolojidir. Yeni nesil dizileme aynı zamanda büyük paralel sıralama veya ikinci nesil sıralama olarak da adlandırılmaktadır. Yeni nesil dizileme, DNA fragmanlarını aynı anda sıralamanın bir yöntemidir. Milyonlarca ila milyarlarca DNA nükleotidi paralel olarak sıralanabilmektedir. Giga baz boyutta okumaları oluşturmak için gereken süre yalnızca birkaç gün veya saattir. Parça klonlama yöntemlerine olan ihtiyacı en aza indirmektedir. Ayrıca, önemli ölçüde daha fazla verim sağlanmaktadır. İlk ticari yeni nesil dizileme teknolojisi, 2004 yılında 454 Life Sciences tarafından tanıtılmış, daha sonra Roche tarafından satın alınmıştır.

Moleküler patoloji, organlar, dokular veya vücut sıvıları içindeki genetik düzeydeki değişimlerin moleküler yöntemler aracılığıyla incelenmesi yoluyla hastalıkların araştırılmasına ve teşhisine odaklanan patoloji'nin yeni gelişmekte olan bir alt dalıdır Moleküler patoloji; tanıyı en uygun hale getirmek, tedaviyi ve hastalığın seyrini en iyi şekilde belirlemek için standart patolojik parametrelere ek olarak, genetik verilerin kullanımı olarak da tanımlanabilmektedir. Önemli bir husus, tanı hem dokulardaki morfolojik değişikliklere hem de moleküler testlere dayandığında daha hassas tanının mümkün olmasıdır.

<span class="mw-page-title-main">Santral dogma (moleküler biyoloji)</span> Biyolojik bir sistem içindeki genetik bilgi akışının açıklanması

Moleküler biyolojinin santral (merkezi) dogması, biyolojik bir sistem içindeki genetik bilgi akışının bir açıklamasıdır. Orijinal anlamı bu olmasa da, genellikle "DNA RNA'yı, RNA proteini yapar" şeklinde ifade edilir İlk olarak 1957'de Francis Crick tarafından ifade edilmiş, 1958'de ise yayınlanmıştır.

<span class="mw-page-title-main">Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu</span>

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan bir moleküler biyoloji laboratuvar tekniğidir. Hedeflenen bir DNA molekülünün amplifikasyonunu geleneksel PCR'da olduğu gibi sonunda değil, PCR sırasında izler. Real-time PCR, kantitatif ve yarı-kantitatif olarak kullanılabilir.


Bu sayfa, bu Vikipedi makalesine dayanmaktadır.
Metin, CC BY-SA 4.0 lisansı altında mevcuttur; ek koşullar uygulanabilir.
Görseller, videolar ve sesler kendi lisansları altında mevcuttur.