İçeriğe atla

Protein çözümleme

Protein çözümleme veya protein assay, bir solüsyondaki çözünmüş formdaki bir proteinin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan analitik spektroskopik bir yöntemdir. Öznel bir yöntemdir, yani örneğin ölçülen bir proteindeki amino asidin bileşimine bağımlıdır. Bu yöntem Marion M. Bradford tarafından bulunduğundan Bradford protein çözümlemesi olarak da bilinir.

Proteinin asidik bir boyanın protein solüsyonuna eklenmesi ve 595 nmde bir spektrofotometre ya da mikroplate okuyucu ile okunması ilkelerine dayanır. Coomassie Brilliant Blue G-250, boyası, 465 nm ila 595 nm'de proteinin bağlanmasıyla tepki verir.

İlke

Test tubes containing Bradford reagent alone (left) and with lysozyme added (right)

Protein çözümlemesi, asidik koşullarda kırmızı, bağlandığı proteinin bazik olması koşullarında ise maviye dönen Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasının renge duyarlı (kolorimetrik) olarak yapıldığı bir yöntemdir.

Bu bileşimin oluşumunda, iki çeşit bağ yer alır: ilkinde Coomassie boyası serbest elektronlarını proteinin iyon gruplarına verir, bu olay proteinin olağan durumunun bozulmasına yol açar ve bu sebeple proteinin hidrofobik bölgeleri açığa çıkar. Proteinin dördüncül yapısındaki bu bölgeler, boyanın kutupsuz bölgelerini van der Waals kuvvetiyle kovalent-olmayan şekilde bağlar ve boyanın negatif yükü yakınındaki pozitif amin gruplarını yeniden konumlandırır. Bu bağ ikinci iyonik etkileşimle daha da güçlendirilir. Proteinin bağlanması Coomassie boyasının mavi formunu sabitler, bu nedenle var olan solüsyonundaki bileşenin miktarı protein yoğunluğunun ölçülmesi için bir orandır ve emilim okunmasıyla saptanabilir.

Boyanın bağlanmış hali en fazla 595 nmde tutulmuştur. Katyonik (bağlanmamış) şekilleri yeşil veya kırmızı olarak görünür. Boyanın proteine bağlanması mavi anyonik formu sabitler. 595 nm emiliminin artışı boyanın miktarıyla orantılıdır ve bu yüzden de örnekteki var olan protein miktarıyla ilişkilidir.

Dezavantajları

Protein çözümlemesi, doğrusal, kısa menzilli bir yöntemdir ve tipik olarak 0 µg/mL ila 2000 µg/mL şeklinde, sıklıkla analizden önce örneklerin dilüsyonu gerektirir. Ayrıca deterjanlar tarafından engellenir.

Doğrusal olmamanın nedeni, proteinin eklenmesiyle karışan boyanın iki formu arasındaki karasızlıktan kaynaklanır.

Bradford protein çözümlemesi, 595 den 450 nm'a kadar olan emilimlerin ölçülmesini doğrusallaştırır. Bu geliştirilmiş assay, geleneksel olandan yaklaşık olarak 10 kez daha duyarlıdır. (Zor & Selinger, 1995)

Prosedür örneği

Materyaller

  • Liyofilize bovin plazma gamma globulini
  • Coomassie Brilliant Blue 1
  • 0.15 M NaCl
  • Spektrofotometre ve tüpler
  • Mikropipetler

Farklı çözümleme yöntemleri

  • Ultraviolet–visible spectroscopy
  • Biuret protein assay
  • Lowry protein assay
  • BCA protein assay
  • Amido black protein assay

Kaynakça

  • Bradford, M.M. (1976), "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal. Biochem., cilt 72, ss. 248-254, doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3, PMID 942051 
  • Zor, T.; Selinger, Z. (1996), "Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies", Anal. Biochem., cilt 236, ss. 302-308, doi:10.1006/abio.1996.0171, PMID 8660509 
  • Noble, J.E.; Bailey, M.J.A. (2009), "Quantitation of Protein", Methods Enzymol., cilt 463, ss. 73-95, doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1 
  • Albright, Brian (2009), Mathematical Modeling with Excel, s. 60, ISBN 978-0763765668 
  • Stephenson, Frank Harold (2003), Calculations for molecular biology and biotechnology: a guide to mathematics in the laboratory, s. 252, ISBN 0126657513 
  • Dennison, Clive (2003), "A guide to protein isolation", Focus on structural biology, cilt 3, s. 39, ISBN 1402012241 
  • Ibanez, Jorge G. (2007), Environmental chemistry: fundamentals, s. 60, ISBN 0387260617 

Dış bağlantılar

Protein çözümleme 22 Eylül 2017 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.

İlgili Araştırma Makaleleri

<span class="mw-page-title-main">DNA</span> Canlıların genetik bilgilerini barındıran molekül

Deoksiriboz nükleik asit veya kısaca DNA, tüm organizmaların ve bazı virüslerin canlılık işlevleri ve biyolojik gelişmeleri için gerekli olan genetik talimatları taşıyan bir nükleik asittir. DNA'nın başlıca rolü bilgiyi uzun süre saklamasıdır. Protein ve RNA gibi hücrenin diğer bileşenlerinin inşası için gerekli olan bilgileri içermesinden dolayı DNA; bir kalıp, şablon veya reçeteye benzetilir. Bu genetik bilgileri içeren DNA parçaları gen olarak adlandırılır. Bazı DNA dizilerinin yapısal işlevleri vardır, diğerleri ise bu genetik bilginin ne şekilde kullanılacağının düzenlenmesine yararlar.

<span class="mw-page-title-main">Antibiyotik</span> bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde ve önlenmesinde kullanılan ilaç

Antibiyotik, bakterilere karşı aktif olan bir tür antimikrobiyal maddedir. Bakteriyel enfeksiyonlarla savaşmak için en önemli antibakteriyel ajan türüdür ve antibiyotik ilaçlar bu tür enfeksiyonların tedavisinde ve önlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bakterileri öldürebilir ya da büyümelerini engelleyebilirler. Sınırlı sayıda antibiyotik de antiprotozoal aktiviteye sahiptir. Antibiyotikler soğuk algınlığı veya gribe neden olan virüsler gibi virüslere karşı etkili değildir; virüslerin büyümesini engelleyen ilaçlar antibiyotik yerine antiviral ilaçlar veya antiviraller olarak adlandırılır. Mantarlara karşı da etkili değildirler; mantarların büyümesini engelleyen ilaçlara antifungal ilaçlar denir.

<span class="mw-page-title-main">Bakteri</span> mikroorganizma üst âlemi

Bakteri (İngilizce telaffuz: [bækˈtɪəriə] ( dinle); tekil isim: bacterium), tek hücreli mikroorganizma grubudur. Tipik olarak birkaç mikrometre uzunluğunda olan bakterilerin çeşitli şekilleri vardır, kimi küresel, kimi spiral şekilli, kimi çubuksu, kimi virgül şeklinde olabilir. Yeryüzündeki her ortamda bakteriler mevcuttur. Toprakta, deniz suyunda, okyanusun derinliklerinde, yer kabuğunda, deride, hayvanların bağırsaklarında, asitli sıcak su kaynaklarında, radyoaktif atıklarda büyüyebilen tipleri vardır. Tipik olarak bir gram toprakta bulunan bakteri hücrelerinin sayısı 40 milyon, bir mililitre tatlı suda ise bir milyondur; toplu olarak dünyada beş nonilyon (5×1030) bakteri bulunmaktadır, bunlar dünyadaki biyokütlenin çoğunu oluşturur. Bakteriler gıdaların geri dönüşümü için hayati bir öneme sahiptirler ve gıda döngülerindeki çoğu önemli adım, atmosferden azot fiksasyonu gibi, bakterilere bağlıdır. Ancak bu bakterilerin çoğu henüz tanımlanmamıştır ve bakteri şubelerinin sadece yaklaşık yarısı laboratuvarda kültürlenebilen türlere sahiptir. Bakterilerin araştırıldığı bilim bakteriyolojidir, bu, mikrobiyolojinin bir dalıdır.

<span class="mw-page-title-main">Penisilin</span> Penicillium mantarlarından elde edilen bir grup antibiyotik

Penisilinler aslen Penicillium küflerinden, özellikle de P. chrysogenum ve P. rubens'ten elde edilen bir grup β-laktam antibiyotiktir. Klinik kullanımdaki penisilinlerin çoğu P. chrysogenum tarafından derin tank fermantasyonu kullanılarak sentezlenir ve daha sonra saflaştırılır. Bir dizi doğal penisilin keşfedilmiştir, ancak sadece iki saflaştırılmış bileşik klinik kullanımdadır: penisilin G ve penisilin V. Penisilinler, stafilokok ve streptokokların neden olduğu birçok bakteriyel enfeksiyona karşı etkili olan ilk ilaçlar arasındaydı. Günümüzde farklı bakteriyel enfeksiyonlar için hala yaygın olarak kullanılmaktadırlar, ancak birçok bakteri türü yoğun kullanımın ardından direnç geliştirmiştir.

Salisilik asit, karboksil grubunun fenoldeki OH grubuna orto pozisyonunda olduğu bir bileşiktir. C6H4 (OH)CO2H kimyasal formülüne sahiptir. Salisilik asit renksiz ve kristal yapıda olan bir beta hidroksi asittir (BHA). Bu asit "2-hidroksibenzoik asit" olarak da bilinir ve suda çok az çözünmektedir. Beyaz söğüt ve keklik üzümü yapraklarının kabuğundan elde edilir. Bir anti-enflamatuar ajan olarak doğrudan aktiviteye sahip olmakla birlikte pul pul dökülmeyi teşvik etme yeteneği nedeniyle topikal bir antibakteriyel ajan görevi görmektedir. Organik yapıdaki bu asit, organik asit sentezinde kullanılmasının yanı sıra bitkisel hormon olarak da kullanılmaktadır.

Kloroform veya triklorometan, CHCl
3
formülüne sahip bir organik bileşiktir. Oda sıcaklığında kolay buharlaşan, hoş kokulu, renksiz, yanıcı olmayan ağır bir sıvıdır. Çözücü olarak sıkça kullanılır. PTFE (Teflon) ve bazı soğutucuların üretiminde kullanılmak için bol miktarlarda üretilir.

<span class="mw-page-title-main">Coomassie</span>

Proteinlerin kantitatif tayininde yaygın olarak kullanılan bir maddedir. Bradford yöntemi olarak bilinin metot oldukça duyarlı bir yöntemdir (5–100 mg/ml); organik boyaların, proteinlerin asidik ve bazik grupları ile etkileşerek, renk oluşturmasını esas alır.

<span class="mw-page-title-main">Vanadyum</span> sembolü V, atom numarası 23 olan kimyasal element

Vanadyum, simgesi V, atom numarası 23 olan bir elementtir. Bir geçiş metali olan element, doğada nadiren bulunur. Yapay olarak izole edildiğinde, oksit bir katmanın ortaya çıkmasıyla pasifleşir ve kararlı hâle gelen elementin oksitlenmesi sona erer.

Ksenon, Xe sembolü ile gösterilen 54 atom numaralı kimyasal elementtir. Renksiz, ağır, kokusuz bir soy gaz olan ksenon Dünya atmosferinde eser miktarda bulunur. Genellikle reaktif olmayan element, sentezlenen ilk soy gaz bileşiği olan ksenon heksafloroplatinatın oluşumu gibi birkaç kimyasal reaksiyona maruz kalabilir.

<span class="mw-page-title-main">Histopatoloji</span> Hastalığı incelemek ve teşhis etmek için dokunun mikroskobik incelenmesi

Histopatoloji ya da patolojik histoloji, hastalıklı dokunun histolojik incelenmesinde uzmanlaşan patoloji dalıdır. Anatomik patoloji açısından önemli bir araç olan histopatoloji, aynı zamanda kanser ve diğer hastalıkların doğru ve kesin teşhisi için kullanılır ve bu açıdan çok önemlidir.

Ultraviyole (UV) veya morötesi; dalga boyu görünür ışıktan kısa, ancak X-ışınlarından uzun olan bir elektromanyetik radyasyon şeklidir. Güneş ışığında bulunur ve Güneş'ten çıkan toplam elektromanyetik radyasyonun yaklaşık %10'unu oluşturur. Ayrıca elektrik arkları, Çerenkov radyasyonu, cıva buharlı lambalar, bronzlaşma lambaları ve siyah ışık gibi kaynaklar tarafından üretilir. Uzun dalga boylu UV fotonları atomları iyonize edecek enerjiye sahip olmadığı için iyonlaştırıcı bir radyasyon olarak kabul edilmese de, kimyasal reaksiyonlara neden olabilir ve birçok maddenin parlamasına neden olabilir. Kimyasal ve biyolojik etkiler de dahil olmak üzere pek çok pratik uygulama, UV radyasyonunun organik moleküllerle etkileşime girmesinden türer. Bu etkileşimler emilimi veya ısıtma dahil moleküllerdeki enerji durumlarının ayarlanmasını içerebilir.

Kolloidal altın, nanoaltın olarak da bilinir, sıvı içinde mikrometre-altı büyüklükte altın tanecikleri süspansiyonudur. Sıvının rengi genelde parlak kırmızı veya pis sarı renklidir.

<span class="mw-page-title-main">Alfa sarmal</span>

Protein ikincil yapısında yaygın bir motif olan alfa sarmal (α-sarmal), sağ-elli burgulu bir biçimdir, omurgadaki her bir N-H grubu, kendinden dört amino asit kalıntısı gerideki omurgadaki C=O grubuna bir hidrojen bağı verir. Bu ikincil yapı bazen klasik Pauling-Corey-Branson alfa sarmalı olarak da adlandırılır. Proteinlerin lokal yapı tipleri arasında α-sarmal, en düzenli olan, diziden öngörüsü yapılması en kolay olan ve ayrıca en yaygın olandır.

<span class="mw-page-title-main">Enzim kinetiği</span>

Enzim kinetiği enzimler tarafından katalizlenen kimyasal reaksiyonların bilimidir. Enzim kinetiğinde reaksiyon hızı ölçülür ve reaksiyon şartlarını değiştirmenin etkisi araştırılır. Bir enzimin kinetiğinin bu şekilde çalışılması enzimin katalitik mekanizmasını, metabolizmadaki rolünü, aktivitesinin nasıl kontrol edildiğini ve bir ilaç veya zehrin enzimi nasıl inhibe edebileceğini ortaya koyabilir.

<span class="mw-page-title-main">Enzim ölçümü</span>

Enzim ölçümleri enzim aktivitesini ölçmek için laboratuvar yöntemleridir. Enzim kinetiğini ve enzim inhibisyonunun araştırılması için önemlidirler.

Bikinkoninik asit tahlili, Smith tahlili olarak da bilinir. Tahlil ismini yaratıcısı Pierce Kimyasal Şirketi' ndeki Paul K. Smith' den alır. Bu biyokimyasal metod, Lowry, Bradford ve Biüret metodlarında olduğu gibi bir solusyondaki total protein konsantrasyonunun belirlenmesinde kullanılır. Total protein konsantrasyonu numune solusyondaki yeşilden mora renk değişimi ile gözükür. Renk değişimi protein konsantrasyonu ile değişir. Kolorimetrik tekniklerin yardımı ile protein konsantrasyonu belirlenir.

<span class="mw-page-title-main">Kütle spektrometrisi</span> Kütle ölçer

Kütle spektrometrisi, İngilizce: Mass spectrometry (MS), kimyasal türleri iyonize edip oluşan iyonları Kütle-yük oranını esas alarak sıralayan bir analitik teknik. Daha basit terimler ile, bir kütle spektrumu bir numunen içindeki kütleleri ölçer. Kütle spektrometrisi birçok farklı alanda kullanılır ve kompleks karışımlara uygulandığı kadar saf numunelere de uygulanır.

İndigo boya, kendine özgü mavi renkte olan organik bileşiktir. Tarihsel olarak indigo, bazı bitkilerin yapraklarından çıkarılan doğal bir boyaydı ve bu süreç ekonomik olarak önemliydi, çünkü mavi boyalar bir zamanlar nadirdi. Bugün üretilen indigo boyanın büyük bir yüzdesi, her yıl birkaç bin ton sentetiktir. Genellikle denim kumaşı ve mavi denim pantolonla ilişkilendirilen mavidir.

<span class="mw-page-title-main">Prusya mavisi</span> Sentetik pigment

Prusya mavisi (aynı zamanda Berlin mavisi veya yağlı boya tablolarda Parizyen veya Paris mavisi olarak bilinir), demir içeren ferrosiyanür tuzlarının oksidasyonu ile üretilen koyu mavi pigmenttir. FeIII4III4[FeII(CN)6]3 kimyasal formülüne sahiptir. Turnbull mavisi kimyasal olarak aynıdır ancak farklı reaktiflerden yapılmıştır ve çeşitli safsızlıklar nedeniyle rengi biraz farklıdır.

Kuantum biyolojisi, kuantum mekaniğinin ve teorik kimyanın biyolojik nesnelere ve problemlere uygulamalarının incelenmesidir. Birçok biyolojik süreç, enerjinin kimyasal dönüşümler için kullanılabilen biçimlere dönüştürülmesini içerir ve doğası gereği kuantum mekaniktir. Bu tür süreçler, kimyasal reaksiyonları, ışık emilimini, uyarılmış elektronik durumların oluşumunu, uyarma enerjisinin aktarımını ve fotosentezi, koku almayı ve hücresel solunum gibi kimyasal süreçlerde elektron ve protonların aktarımını içerir.