Plazmid

Plazmidler; bakteriler, arkeler ve ökaryotlar arasında birçok mikroorganizmada bulunan dairesel veya çizgisel ekstrakromozomal replikonlardır. Bakterilerin genetik bilgiyi aktarması, hızlı evrimleşmelerini ve adaptasyonlarını kolaylaştırması için önemli araçlardır.^[1] Hedeflenen genleri ekleyerek, değiştirerek veya silerek mikroorganizmaları manipüle etmek ve analiz etmek için önemli araçlar olarak hizmet eder.^[2]^[3] Prokaryotik hücrelerde bulunurlar ve kromozomlardan bağımsız olarak çoğalırlar. Ek olarak, plazmidler hücreler arasında aktarılabilir, bu da onları prokaryotik evrimde önemli itici güçler olarak kabul eder ve onları yanal gen aktarımına aracılık eden güçlü ajanlar yapar. Antibiyotik direnci gibi yeni işlevler sağlayarak konakçı evrimini hızlandırmakla kalmazlar, aynı zamanda artan gen ifade seviyeleri ve kopya sayısı değişiklikleri yoluyla mutasyonların edinim oranlarına da yol açabilirler.^[4] Plazmid genomları genellikle, aynı aileden ilgili plazmidler arasında korunan ve replikasyon ve hareketlilik gibi önemli plazmide özgü işlevlerle ilişkili çekirdek lokusların bir omurgasını içerir. Etkili yatay gen transfer (HGT) vektörleri olarak görev yapar.^[5]

Plazmidlerin boyu 1 ila 400 kilobaz çifti arasında değişir. Bir hücrede büyük bir plasmidin bir kopyası, daha küçük boy plazmidlerin ise yüzlerce kopyası bulunabilir. Hatta, yüksek kopya sayısına sahip olması amacıyla seleksiyona uğratılmış bazı yapay plazmidlerin (örneğin pUC plazmid serisindekilerin) binlerce kopyası olabilir.

Plazmid terimi Amerikalı moleküler biyolog Joshua Lederberg tarafından 1952'de ilk defa kullanılmıştır.^[6]

Antibiyotik direnci

Çoğu plazmid içinde bulundukları bakteriye selektif avantaj sağlayan, bakteriyi bir antibiyotiğe dirençli yapmak gibi özellikler sağlayan genler veya gen grupları taşırlar.

Her plazmid kromozomdan bağımsız olarak kopyalanmasını sağlayan, bir DNA dizinine sahiptir. Replikasyon orijini (İngilizce origin of replication) veya 'ori' olarak adlandırılan bu dizin DNA replikasyonunun başlama noktasıdır (şekil 2). Çoğu plazmid, Şekil 2'de gösterildiği gibi daireseldir ama ökaryotların kromozomlarına yüzeysel olarak benzeyen, doğrusal (lineer) plazmidlerde vardır. Antibiyotiklere direnç, bir direnç determinantı (R determinantı) ve bir direnç transfer faktörü (RTF) taşıyan bir plazmid olan R faktörü adı verilen bir faktörden türetilir. İki R plazmid bileşeninin aynı hücrede mevcut olduğunda etkilidir. R belirteci iletilmediği için RTF tek başına ilaç direnci geliştiremez. Ayrıca ilaç direnci iletimi, su sıcaklığına ve diğer fizikokimyasal parametrelere bağlıdır.^[7]^[8]^[9]

Epizomlar

Epizom, konak organizmanın kromozom DNA ile bütünleşebilen bir plazmiddir. Bu yüzden uzun süre bütünlüğünü koruyabilir, her hücre bölünmesinde kopyalanır ve genetik yapının bir parçası olarak varlığını sürdürür. Plazmidler için bu terim artık kullanılmamaktadır çünkü bir plazmidin epizom olmasına nedeni, hem o hem kromozomda bulunan, transpozon gibi bir homolog bölgenin varlığıdır. Memeli hücrelerinde epizom terimi, konak kromozomlardan birine kovalent olmayan şekilde başlanmış dairesel DNA (viral bir genom gibi) için kullanılır.^[10]^[11]

Vektörler

Genetik mühendisliğinde kullanılan plazmidlere vektör denir. Bir canlıdan diğerine gen aktarımı için kullanılırlar ve genelde seleksiyon için kullanılabilecek bir fenotip oluşturan bir genetik işaret taşırlar. Çoğu vektörde bir çoklubağlaç (İngilizce polylinker veya çoklu klonlama yeri (İngilizce multiple cloning site) de bulunur, buraya DNA parçalarının kolayca eklenmesi için yaygınca kullanılan restriksiyon yerleri içeren kısa bir bölgedir.

Viral vektörler, genetik materyali hücrelere iletmek için moleküler biyologlar tarafından yaygın olarak kullanılan araçlardır. Bu işlem canlı bir organizma içinde (in vivo) veya hücre kültürü içinde (in vitro) gerçekleştirilebilir. Virüsler, genomlarını enfekte ettikleri hücreler içinde verimli bir şekilde taşımak için özel moleküler mekanizmalar geliştirmiştir. Genlerin veya diğer genetik materyalin bir vektör tarafından iletilmesi, transdüksiyon olarak adlandırılır ve enfekte olmuş hücreler, transdükte olarak tanımlanır. Moleküler biyologlar bu makineyi ilk kez 1970'lerde kullandılar. Paul Berg, kültürde tutulan maymun böbrek hücrelerini enfekte etmek için bakteriyofaj λ'dan DNA içeren değiştirilmiş bir SV40 virüsü kullandı.^[12]

Klonlama vektörü, bir organizmada stabil bir şekilde muhafaza edilebilen ve içine klonlama amacıyla yabancı bir DNA parçasının yerleştirilebildiği küçük bir DNA parçasıdır.^[13] Klonlama vektörü, bir virüsten, daha yüksek bir organizmanın hücresinden alınan DNA veya bir bakterinin plazmidi olabilir. Vektör, bir DNA fragmanının vektöre uygun bir şekilde eklenmesine veya vektörden çıkarılmasına, örneğin kısıtlama bölgelerinin mevcudiyeti yoluyla izin veren özellikler içerir. Vektör ve yabancı DNA, DNA'yı kesen bir kısıtlama enzimi ile işlenebilir ve bu şekilde oluşturulan DNA fragmanları, künt uçlar veya yapışkan uçlar olarak bilinen çıkıntılar içerir ve vektör DNA ve uyumlu uçlara sahip yabancı DNA daha sonra moleküler olarak birleştirilebilir. ligasyon. Bir DNA fragmanı bir klonlama vektörüne klonlandıktan sonra, daha spesifik kullanım için tasarlanmış başka bir vektöre alt klonlanabilir. Pek çok klonlama vektörü türü vardır, ancak en yaygın kullanılanları genetik olarak tasarlanmış plazmidlerdir. Klonlama genellikle ilk olarak Escherichia coli kullanılarak gerçekleştirilir ve E. coli'deki klonlama vektörleri arasında plazmidler, bakteriyofajlar (faj λ gibi), kozmitler ve bakteriyel yapay kromozomlar (BAC'ler) bulunur. Bununla birlikte, bazı DNA, örneğin çok büyük DNA fragmanları gibi E. coli'de sabit bir şekilde muhafaza edilemez ve maya gibi diğer organizmalar kullanılabilir. Mayadaki klonlama vektörleri, maya yapay kromozomlarını (YAC'ler) içerir.

Ekspresyon vektörü, genellikle hücrelerde gen ekspresyonu için tasarlanmış bir plazmid veya virüstür. Vektör, belirli bir geni bir hedef hücreye sokmak için kullanılır ve gen tarafından kodlanan proteini üretmek için hücrenin protein sentezi mekanizmasına kumanda edebilir. Ekspresyon vektörleri, protein üretimi için biyoteknolojideki temel araçlardır. Vektör, güçlendirici ve promotör bölgeler olarak hareket eden ve ekspresyon vektörü üzerinde taşınan genin verimli transkripsiyonuna yol açan düzenleyici dizileri içerecek şekilde tasarlanmıştır.^[14] İyi tasarlanmış bir ekspresyon vektörünün amacı, verimli protein üretimidir ve bu, daha sonra proteine çevrilebilen önemli miktarda kararlı mesajcı RNA'nın üretilmesiyle gerçekleştirilebilir. Bir proteinin ekspresyonu sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve protein, yalnızca gerekli olduğunda bir indükleyicinin kullanılması yoluyla önemli miktarda üretilir, ancak bazı sistemlerde protein yapısal olarak eksprese edilebilir. Escherichia coli, protein üretimi için konakçı olarak yaygın olarak kullanılır, ancak diğer hücre türleri de kullanılabilir. Ekspresyon vektörünün kullanımına bir örnek, diyabetin tıbbi tedavilerinde kullanılan insülin üretimidir.

Tipleri

Plazmidleri sınıflandırmanın bir yolu, başka bir bakteriye kendini aktarabilme yeteneğine göredir. Konjügatif plazmidler tra-genleri taşırlar, bunlar, bir plazmidin başka bir bakteriye trasnferi olan konjugasyon olayının gerçekleşmesini sağlarlar. Nonkonjügatif plazmidler konjügasyonu başlatamazlar, ancak konjügatif plazmidlerin yardımıyla, 'kazara' aktarılabililer. Bir ara sınıf olarak seferber edilebilir (İngilizce mobilizable) plazmidler sayılabilir, bunlar aktarım için gereken genlerin bir kısmına sahip oldukları için konjügatif plazmidlerin paraziti gibi davranırlar, ancak onların varlığında yüksek frekansta transfer olabilirler.^[15]

Farklı tiplerde plazmidlerin bir hücrede beraber bulunmaları mümkündür. E. coli 'de yedi farklı plazmid bir arada bulunmuştur. Ancak ilişkili plazmidler birbiriyle bağışıksızdır, yani temel plazmid işlevlerinin denetiminin bir sonucu olarak bunlardan sadece bir tipi varlığını sürdürebilir. Dolayısıyla plazmidler uyumluluk grupları 'na ayrılırlar.

Plazmidlerin bir diğer sınıflandırması işlevlerine göredir. Beş ana sınıf vardır:

Fertilite F-Plazmidleri Doğurganlık plazmidleri veya F-plazmidleri, F+ veya erkek bakteri hücrelerinde bulunan ve sıklıkla transfer edilen ve nadiren bakteriyel kromozom transferine yol açan konjugatif plazmidlerin kapsamlı bir kategorisinin parçasıdır (Şekil 1). F-plazmidleri kromozomal DNA'ya yerleştirilebilir ve epizomlar olarak adlandırılır. plazmid içeren bakteriler F pozitif (F+) olarak adlandırılır ve plazmid içermeyenler F negatif (F-) olarak adlandırılır. Bir F+ bakterisinin bir F– bakterisi ile konjugasyonu üzerine iki F+ bakterisi oluşur. Her bakteri yalnızca bir F-plazmidi içerebilir.^[16]
Rezistans-(R) Plazmidleri Bu plazmidler, antibiyotikler veya zehir direnci genleri içerir ve bakteriyel pili üretimine yardımcı olur (plazmidin doğası anlaşılmadan önce tarihsel olarak R-faktörleri olarak bilinir). Direnç plazmidleri, kendilerini transfer etmek için konjugasyonu kullanma yeteneğine sahiptir, böylece antibiyotiklere karşı bakteriyel suş direnci sağlar. Bakterilerde antibiyotiklere karşı direnç 5 yıl içinde bile ortaya çıkabilmektedir. Bununla birlikte NPR, İYE gibi enfeksiyonların tedavisi için aşırı antibiyotik kullanımının ilaca dirençli suşların ortaya çıkmasına neden olabileceğini belirtti.
Col-Plazmidler Col-plazmidleri, kolisin olarak da adlandırılan bakteriyosinlerin üretiminden sorumlu genleri içerir. Bu proteinler, diğer bakterileri öldürerek konakçı bakteriyi savunabilir. Çok sayıda bakteri türü, ColE1 plazmidinin varlığı nedeniyle E. coli gibi bakteriyosinler üretir.^[16]
Yıkıcı Plazmidler Parçalayıcı plazmidlerin ana işlevi, kafur, salisilik asit, toluen ve ksilen gibi doğada yaygın olarak bulunmayan bileşiklerin sindirilmesinde konakçı bakteriye yardımcı olmaktır. Bu nedenle, bu plazmidler, belirli bileşikleri parçalamak için ana işlevi olan enzimler için genleri kapsar (Şekil 2). Parçalayıcı plazmidler eşlenik olarak tanımlanabilir.
Virülans Plazmidler Bakteri içeren bir virülans plazmidi, bu bakteriyi bir patojen veya bir hastalık ajanı haline getirecektir. Hastalığa neden olan bakteriler bireyler arasında kolayca yayılır ve yeni konakçıda çoğalarak enfeksiyona neden olur. Örneğin, Escherichia coli bakterisi için birkaç virülans plazmidi vardır. E. coli insan ve hayvan bağırsağında doğal olarak bulunmasına rağmen, bazı E. coli suşları şiddetli kusma ve ishale neden olabilir. Salmonella enterica, bakteri içeren bir virülans plazmidinin ek bir örneğidir.^[17]

Plazmidler bu grupların birden fazlasının birden üyesi olabilirler.

Her bakteride bir veya birkaç kopya halinde bulunan plazmidler, hücre bölünmesinin ardından yavru bakterilerden birine aktarılmama riskini taşırlar. Bu tür tek kopyalı plazmidler her yavru hücreye plazmidin bir kopyasının dağıtılmasını sağlayan sistemlere sahiptirler.

Bazı plazmidler bir bağımlılık sistemi veya ayrılma sonrası öldürme sistemi (İngilizce "postsegregational killing system (PSK)") içerirler. Hem uzun etkili bir zehir ve kısa etkili bir panzehir üretirler. Plazmidi tutan yavru hücreler sağ kalırlar, plazmidin bir kopyasını almamış bir yavru hücre ise ya ölür ya da ana hücreden kalan zehirin etkisiyle yavaş büyür. Bu plazmidlerin "bencil DNA" yönlerinin bir örneğidir.

Uygulamaları

Plazmidler biyokimya ve moleküler biyolojide kullanılan önemli araçlardır.^[18] Genlerin çoğaltılması (pek çok kopyasının elde edilmesi) veya ifadesi için kullanılan ticari kaynaklı pek çok plazmid mevcuttur.^[19]

Çoğaltılacak olan genin kopyası, hücreleri belli bir antibiyotiğe dayanıklı yapan genler içeren bir plazmide eklenir. Sonra plazmid, transformasyon olarak adlandırılan bir yöntemle bakterilerin içine sokulur. Ardından bakteriler o antibiyotiğe maruz bırakılırlar. Plazmid onları dirençli kıldığı için yalnızca plazmidi içine almış bakteriler antibiyotikli ortamda sağ kalırlar. Bu bakteriler çok sayıda büyütülürler, sonra toplanıp eritilerek (lizis) içlerindeki plazmid izole edilir.

Gen terapisi ve DNA aşılaması, belirli bir hastalık (kalıtsal/kazanılmış) ile ilgili gen(ler)in tanımlanmasını, terapötik genin fabrikasyonunu, bir moleküler vektörün tasarımını (ve formülasyonunu) ve genin hastaya verilmesini gerektirir. Gen hastada ifade edildikten sonra doğru hastanın oluşması ve işlev görmesi beklenir. Bununla birlikte, rekombinant protein üretimi ile ilgili problemler, örneğin: kompleks glikosilasyon ortadan kalkar. Genetik bilgiyi insan hücrelerine sokmak için olası ilgili vektörler mevcuttur. En alakalı olanları virüs (adenovirüs/retrovirüs) ve plazmid DNA'dır (pDNA): her ikisi de sulu solüsyonda kullanılabilir veya lipidlere veya diğer formülasyonlara dahil edilebilir.^[20]

Plazmidlerin bir diğer kullanımı çok miktarda protein üretimidir. Bu durumda arzu edilen geni taşıyan plazmidi içeren bakteriler büyütülür. Bakteriler antibiyotik direnci sağlayan proteinlerini üretmeye başlattıkları sırada eklenmiş genden bol miktarda protein üretmesini sağlayacak şekilde uyarılabilir. Bu şekilde bir gen veya onun kodladığı bir protein (örneğin insülin), hatta antibiyotikler ucuz ve kolay bir şekilde üretilebilir.

Plazmid DNA eldesi

Plazmidler çoğu zaman belli DNA dizinlerinin saflaştırılması için kullanılırlar, çünkü genomun geri kalanından kolayca ayrıştırılabilir. Vektör olarak kullanımları ve moleküler klonlama için plazmidlerin izole edilmesi gerekir.

Bakterilerden plazmid DNA'sı elde etmenin birkaç yöntemi vardır. Bunlar;

Miniprep

plazmid DNA'nın mini hazırlığı, plazmid DNA'nın bakterilerden hızlı, küçük ölçekli izolasyonudur.^[21] Elde edilen DNA çok saf olmamakla beraber restriksiyon sindirimi ve bazı basit klonlama tekniklerine yetecek kalitededir.

Midiprep

Midiprep tekniğinde orta hacimli hücre süspansiyonu kullanılır. Saflaştırılmış plazmid DNA, restriksiyon endonükleaz sindirimi, PCR, klonlama, transformasyon, otomatik sıralama, in vitro transkripsiyon ve sağlam hücre hatlarının transfeksiyonu gibi çok çeşitli moleküler biyoloji prosedürlerinde kullanılabilir.^[22]

Maksiprep

Maksiprep tekniğinde büyük hacimli hücre süspansiyonu kullanılır. Yapılan işlem esas olarak büyük ölçekli bir miniprep tekniğidir, üzerine ek saflaştırma adımları gelir.Sonuçta nispeten bol miktarda (birkaç mg) çok saf plazmid DNA'dır.^[23]

Yakın yıllarda farklı ölçeklerde, saflık derecelerinde ve otomasyon seviyelerinde plazmid saflaştırması yapmayı sağlayan çeşitli ticari kitler oluşturulmuştur.

Biçimler

Plazmid DNA beş farklı biçimde (konformasyonda) olabilir, bunlar elektroforezle farklı hızlarda ayrışırlar. Bu konformasyonlar elektroforez hız sırasına göre, en yavaştan en hızlıya aşağıda listelenmiştir:

Çentikli açık dairesel DNA'nın bir zinciri kesiktir
Doğrusal DNA'nın iki ucu da açıktır, ya hücre içinde de böyle olduğu için veya dairesel plazmidin iki zinciri de kesilmiş olduğu için. Bu, bir bir ucu öbür ucuna takılı olmayan bir elektrik uzatma kablosuna benzetilebilir.
Gevşek dairesel DNA'nın iki zinciri sağlamdır ama enzimler tarafından gevşetilmiş, yani aşırı sargısı giderilmiştir. Bir ucu öbürüne takılı elektrik uzatma kablosuna benzetilebilir.
Aşırı sargılı denşirik (İngilizce supercoiled denatured) DNA, iki sarmalı da kesilmemiş ama bazı kısımları eşlenmemiş olduğu için biraz daha az sıkıdır. İçindeki iki telinin yer yer ayrık olduğu bir uzatma kablosunun kendi etrafında sarıldıktan sonra bir ucunun öbürüne takılmış haline benzetilebilir.
Aşırı sargılı DNA (veya kovalent kapalı dairesel DNA) her iki zinciri de kesik olmayan ve kendi etrafında sarılı olmak sonucunda sıkı bir yapıya sahip olan DNA'dır. İyi durumda bir elektrik kablosunu kendi etrafında sardıktan sonra bir ucunu öbürüne takılmış haline benzetilebilir.