CYP3A4

Sitokrom P450 3A4 (kısaltılmış hali CYP3A4), vücutta esas olarak karaciğerde ve bağırsakta bulunan önemli bir enzimdir. Toksinler veya ilaçlar gibi küçük yabancı organik molekülleri (ksenobiyotikler) okside eder, böylece vücuttan atılabilirler. Bir başka önemli CYP3A enzimi olan CYP3A5 ile oldukça homologdur.^[1]

Birçok ilaç CYP3A4 tarafından deaktive edilirken, enzim tarafından aktive edilen bazı ilaçlar da vardır. Greyfurt suyunda bulunan bazı ilaçlar ve furanokumarinler gibi bazı maddeler CYP3A4'ün etkisini engeller. Dolayısıyla bu maddeler, CYP3A4 tarafından modifiye edilen ilaçların etkisini artıracak ya da zayıflatacaktır.

CYP3A4, oksitleyici enzimlerin sitokrom P450 ailesinin bir üyesidir. Bu ailenin diğer birkaç üyesi de ilaç metabolizmasında rol oynar, ancak CYP3A4 en yaygın ve en çok yönlü olanıdır. Bu ailenin tüm üyeleri gibi o da bir hemoproteindir, yani bir demir atomu ile bir hem grubu içeren bir proteindir. İnsanlarda CYP3A4 proteini CYP3A4 geni tarafından kodlanır. Bu gen, 7q22.1 kromozomu üzerindeki sitokrom P450 genleri kümesinin bir parçasıdır. Önceleri başka bir CYP3A geni olan CYP3A3'ün var olduğu düşünülüyordu; ancak artık bu dizinin CYP3A4'ün bir transkript varyantını temsil ettiği düşünülmektedir. Farklı izoformları kodlayan alternatif olarak eklenmiş transkript varyantları tanımlanmıştır.

CYP3A4, sitokrom P450 süper enzim ailesinin bir üyesidir. Sitokrom P450 proteinleri, ilaç metabolizmasında ve kolesterol, steroidler ve diğer lipid bileşenlerinin sentezinde yer alan birçok reaksiyonu katalize eden monooksijenazlardır.^[2]

CYP3A4 proteini endoplazmik retikuluma lokalize olur ve ekspresyonu glukokortikoidler ve bazı farmakolojik ajanlar tarafından indüklenir. Sitokrom P450 enzimleri reçete edilen ilaçların yaklaşık %60'ını metabolize eder ve CYP3A4 bu metabolizmanın yaklaşık yarısından sorumludur; substratlar arasında asetaminofen (parasetamol), kodein, siklosporin (siklosporin), diazepam, eritromisin ve klorokin bulunur.^[3] Enzim ayrıca bazı steroidleri ve karsinojenleri de metabolize eder. Çoğu ilaç CYP3A4 tarafından ya doğrudan ya da vücuttan atılımı kolaylaştırılarak deaktivasyona uğrar. Ayrıca, birçok madde aktif bileşiklerini oluşturmak üzere CYP3A4 tarafından biyoaktive edilir ve birçok protoksin toksik formlarına dönüştürülür.^[4]

CYP3A4 ayrıca araşidonik asidi epoksiyeikosatrienoik asitlere (EET'ler), yani (±)-8,9-, (±)-11,12- ve (±)-14,15-epoksiyeikosatrienoik asitlere metabolize ettiği için epoksijenaz aktivitesine sahiptir. EET'lerin belirli kanser türlerinin teşvik edilmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli faaliyetleri vardır (bkz. epoksiyeikosatetraenoik asit). CYP3A4, bu hücreleri büyümeye teşvik eden (±)-14,15-epoksiyeikosatrienoik asitler üreterek kültürdeki çeşitli insan kanser hücre dizilerinin büyümesini teşvik eder. Sitokrom P450'nin ayrıca araşidonik asidi 20-Hidroksyeikosatetraenoik aside (20-HETE) metabolize etmek için yağ asidi monooksgenaz aktivitesine sahip olduğu bildirilmiştir.^[5] 20-HETE, meme ve diğer kanser türlerinde büyüme stimülasyonunu içeren geniş bir aktivite yelpazesine sahiptir (bkz. 12-hidroksyeikosatetraenoik asit).

Fetüsler karaciğer dokularında CYP3A4'ü değil, benzer substratlar üzerinde etkili olan CYP3A7'yi (EC 1.14.14.1) eksprese ederler. CYP3A4 yaşamın dördüncü ayında yetişkin seviyelerinin yaklaşık %40'ına ve 12. ayda %72'sine yükselir.^[6]

CYP3A4 ağırlıklı olarak karaciğerde bulunmasına rağmen, metabolizmada önemli bir rol oynayabileceği vücudun diğer organlarında ve dokularında da bulunur. Bağırsaktaki CYP3A4 bazı ilaçların metabolizmasında önemli bir rol oynar. Genellikle bu, histamin H1-reseptör antagonisti terfenadin örneğinde olduğu gibi ön ilaçların aktive edilmesini ve emilmesini sağlar. Son zamanlarda CYP3A4 beyinde de tanımlanmıştır, ancak merkezi sinir sistemindeki rolü hala bilinmemektedir.

Sitokrom P450 enzimleri, endojen ve eksojen bileşiklerin metabolizmasında karmaşık kimyasal değişiklikler gerçekleştirmek için geniş aktif bölgesini ve aynı anda birden fazla substratı bağlama yeteneğini kullanarak çeşitli ligandlar üzerinde çeşitli modifikasyonlar gerçekleştirir. Bunlar arasında hidroksilasyon, olefinlerin epoksidasyonu, aromatik oksidasyon, heteroatom oksidasyonları, N- ve O- dealkilasyon reaksiyonları, aldehit oksidasyonları, dehidrojenasyon reaksiyonları ve aromataz aktivitesi yer alır.^[7]

Bir sp3 C-H bağının hidroksilasyonu, CYP3A4'ün (ve sitokrom P450 oksijenazların) ligandını etkileme yollarından biridir. Aslında, hidroksilasyonu bazen dehidrojenasyon takip ederek daha karmaşık metabolitlere yol açar. CYP3A4 nedeniyle birden fazla reaksiyona giren bir molekül örneği, 4-hidroksi-tamoksifene hidroksile edilen ve daha sonra 4-hidroksi-tamoksifen kinon metide dehidre edilen tamoksifeni içerir.

P450 enzimlerinde hidroksilasyonun birincil yolu olarak iki mekanizma önerilmiştir. Bir sp3 C-H bağının hidroksilasyonu için kullanılan en yaygın önerilen mekanizmalardan ikisi. Önerilen ilk yol, kafes kontrollü bir radikal yöntemidir ("oksijen geri tepmesi") ve ikincisi, bir radikal ara ürün kullanmayan, bunun yerine bir "radikal saat" aracılığıyla çok hızlı hareket eden uyumlu bir mekanizmayı içerir

1998 yılında, çeşitli araştırmacılar greyfurt suyunun ve genel olarak greyfurtun, çeşitli ilaçların metabolizmasını etkileyerek biyoyararlanımlarını artırabilen güçlü bir CYP3A4 inhibitörü olduğunu göstermiştir. Bazı durumlarda bu, astemizol veya terfenadin gibi ilaçlarla ölümcül bir etkileşime yol açabilir.Greyfurt suyunun ilaç emilimi ile ilgili etkisi ilk olarak 1989 yılında keşfedilmiştir. Greyfurt ilaç etkileşimlerine ilişkin ilk yayınlanmış rapor 1991 yılında Lancet dergisinde "Narenciye Sularının Felodipin ve Nifedipin ile Etkileşimleri" başlığıyla yayınlanmıştır ve klinik olarak bildirilen ilk gıda-ilaç etkileşimidir. Greyfurtun etkileri 3-7 gün arasında sürmekte olup, en büyük etkiler ilacın uygulanmasından bir saat önce meyve suyu alındığında ortaya çıkmaktadır.

Greyfurtun yanı sıra diğer meyveler de benzer etkilere sahiptir. Örneğin Noni (Morinda citrifolia), tipik olarak meyve suyu olarak tüketilen bir besin takviyesidir ve aynı zamanda CYP3A4'ü inhibe eder. Nar suyu sınırlı çalışmalarda bir miktar inhibisyon göstermiştir, ancak henüz insanlarda etkisini göstermemiştir.^[8]

CYP3A4 geninde 28'den fazla tek nükleotid polimorfizmi (SNP) tanımlanmış olsa da, bunun in vivo olarak önemli bireyler arası değişkenliğe dönüşmediği bulunmuştur. Bunun, substratlara maruz kalındığında CYP3A4'ün indüklenmesinden kaynaklanabileceği düşünülebilir.

Yabani tipe kıyasla minimal fonksiyona sahip olduğu bildirilen CYP3A4 alelleri arasında CYP3A4*6 (bir A17776 eklemesi) ve CYP3A4*17 (F189S) bulunmaktadır. Bu SNP'lerin her ikisi de vahşi tip metabolizmaya kıyasla testosteron ve nifedipin dahil olmak üzere belirli ligandlarla katalitik aktivitenin azalmasına yol açmıştır. Buna karşılık, CYP3A4*1G aleli CYP3A4*1A'ya (vahşi tip alel) kıyasla daha güçlü enzimatik aktiviteye sahiptir.

CYP3A4 fonksiyonundaki değişkenlik eritromisin nefes testi (ERMBT) ile noninvaziv olarak belirlenebilir. ERMBT, intravenöz (14C-N-metil)-eritromisin dozundan sonra dışarı verilen radyolabelled karbondioksiti ölçerek in vivo CYP3A4 aktivitesini tahmin eder.^[9]

CYP3A4 çok çeşitli ligandlar tarafından indüklenir. Bu ligandlar pregnan X reseptörüne (PXR) bağlanır. Aktive olan PXR kompleksi, CYP3A4 geninin XREM bölgesine bağlanan retinoid X reseptörü (RXR) ile bir heterodimer oluşturur. XREM, CYP3A4 geninin düzenleyici bir bölgesidir ve bağlanma, genin proksimal promotör bölgeleri ile işbirliğine dayalı bir etkileşime neden olarak CYP3A4'ün transkripsiyonunun ve ekspresyonunun artmasına neden olur. PXR/RXR heterodimerinin aktivasyonu CYP3A4 promotör bölgesinin ve geninin transkripsiyonunu başlatır. Ligand bağlanması, aflatoksin B1, M1 ve G1 varlığında olduğu gibi CYP3A4 ligandlarının varlığında artar. Aslında, enzimin geniş ve şekillendirilebilir aktif bölgesi nedeniyle, enzimin aynı anda birden fazla ligandı bağlaması mümkündür ve bu da potansiyel olarak zararlı yan etkilere yol açar.^[10]

CYP3A4 indüksiyonunun insanlarda cinsiyete bağlı olarak değiştiği gösterilmiştir. Kanıtlar, vücut ağırlığındaki farklılıklar hesaba katıldığında bile kadınlarda CYP3A4 tarafından ilaç klirensinin arttığını göstermektedir. Wolbold ve arkadaşları (2003) tarafından yapılan bir çalışmada, rastgele bir kadın örnekleminin cerrahi olarak çıkarılan karaciğer örneklerinden ölçülen medyan CYP3A4 seviyelerinin, erkeklerin karaciğerlerindeki CYP3A4 seviyelerini %129 oranında aştığı bulunmuştur. CYP3A4 mRNA transkriptlerinin benzer oranlarda bulunması, kadınlarda CYP3A4'ün yukarı regülasyonu için translasyon öncesi bir mekanizma olduğunu düşündürmektedir. Kadınlardaki bu yüksek enzim seviyesinin kesin nedeni hala spekülasyon altındadır, ancak çalışmalar hem erkeklerde hem de kadınlarda ilaç klirensini etkileyen diğer mekanizmaları (düşük CYP3A4 seviyeleri için CYP3A5 veya CYP3A7 telafisi gibi) aydınlatmıştır.

CYP3A4 substrat aktivasyonu farklı hayvan türleri arasında değişiklik gösterir. Bazı ligandlar insan PXR'sini aktive ederek CYP3A4 transkripsiyonunu teşvik ederken diğer türlerde aktivasyon göstermez. Örneğin, fare PXR'si rifampisin tarafından aktive edilmez ve insan PXR'si pregnenolon 16α-karbonitril tarafından aktive edilmez. CYP3A4 fonksiyonel yolaklarının in vivo çalışılmasını kolaylaştırmak amacıyla, null/insan CYP3A4 ve PXR çaprazlamaları üretmek için transgenler kullanılarak fare suşları geliştirilmiştir. İnsanlaştırılmış hCYP3A4 fareleri enzimi bağırsak sistemlerinde başarılı bir şekilde ifade etmelerine rağmen, karaciğerde düşük seviyelerde hCYP3A4 bulunmuştur. Bu etki, büyüme hormonu sinyal iletim yolu tarafından CYP3A4 düzenlemesine bağlanmıştır. İn vivo bir model sağlamanın yanı sıra, insanlaştırılmış CYP3A4 fareleri (hCYP3A4), CYP3A4 aktivitesindeki cinsiyet farklılıklarını daha fazla vurgulamak için kullanılmıştır.

CYP3A4 aktivite seviyeleri ayrıca diyet ve ksenobiyotik maddelere maruz kalma süresi gibi çevresel faktörlerle de ilişkilendirilmiştir. Enzimin bağırsak mukozasındaki yaygın varlığı nedeniyle, enzim açlık semptomlarına karşı hassasiyet göstermiş ve olumsuz etkilere karşı savunmada yukarı doğru düzenlenmiştir. Gerçekten de, yağlı başlı minnowlarda, beslenmemiş dişi balıkların PXR ve CYP3A4 ifadesinin arttığı ve birkaç günlük açlıktan sonra maruz kaldıktan sonra ksenobiyotik faktörlere daha belirgin bir tepki gösterdiği gösterilmiştir. Araştırmacılar, hayvan modellerini inceleyerek ve CYP3A4 aktivasyonundaki doğuştan gelen farklılıkları akılda tutarak, insan CYP3A4 yolaklarında ilaç metabolizmasını ve yan etkileri daha iyi tahmin edebilirler.

İnsan CYP3A4'ün devir hızına ilişkin tahminler büyük farklılıklar göstermektedir. Hepatik CYP3A4 için, in vivo yöntemler enzim yarılanma ömrünün tahminlerini esas olarak 70 ila 140 saat aralığında verirken, in vitro yöntemler 26 ila 79 saat arasında tahminler verir. Bağırsak CYP3A4'ün devir hızı muhtemelen enterosit yenilenme oranının bir fonksiyonudur; greyfurt suyuna maruz kaldıktan sonra aktivitenin geri kazanılmasına dayanan dolaylı bir yaklaşım 12 ila 33 saat aralığında ölçümler verir.^[11]

Membrana bağlı CYP3A4'ün doğal topaklanma eğilimi nedeniyle, hem çözeltide hem de yüzeylerde ilaç bağlanmasını incelemek tarihsel olarak zor olmuştur. Substratlar düşük KD'ye (5-150 μM arasında) ve sulu çözeltilerde düşük çözünürlüğe sahip olma eğiliminde olduklarından ko-kristalizasyon zordur. Bağlı enzimi izole etmede başarılı bir strateji, monomerik CYP3A4'ün nanosfer litografisinden üretilen gümüş nanopartiküller üzerinde fonksiyonel stabilizasyonudur ve lokalize yüzey plazmon rezonans spektroskopisi (LSPR) ile analiz edilir. Bu analizler, ilaç bağlanmasının yüksek hassasiyetli bir tahlili olarak kullanılabilir ve ilk ilaç keşif testlerinde kullanılan daha yüksek verimli tahlillerin ayrılmaz bir parçası haline gelebilir. LSPR'ye ek olarak, CYP3A4-Nanodisk komplekslerinin katı hal NMR, redoks potansiyometrisi ve kararlı hal enzim kinetiği gibi diğer uygulamalarda da yararlı olduğu görülmüştür.^[12]