Alan hedefli mutajenez

Alan hedefli mutajenez, bir genin DNA dizisinde ve herhangi bir gen ürününde spesifik ve kasıtlı değişiklikler yapmak için kullanılan bir moleküler biyoloji yöntemidir. Ayrıca alana özgü mutajenez veya oligonükleotide yönelik mutajenez olarak da adlandırılan bu, DNA, RNA ve protein moleküllerinin yapısını ve biyolojik aktivitesini araştırmak ve protein mühendisliği için kullanılır.

Alan hedefli mutajenez, mutasyonları DNA dizilerine sokarak DNA kitaplıkları oluşturmak için en önemli laboratuvar tekniklerinden biridir. Bölgeye yönelik mutajenez elde etmek için çok sayıda yöntem vardır, ancak oligonükleotit sentezinin maliyetlerinin azalmasıyla, yapay gen sentezi artık bazen bölgeye yönelik mutajenez yerine bir alternatif olarak kullanılmaktadır. 2013 yılından bu yana, prokaryotik bir viral savunma sistemine dayalı CRISPR / Cas9 teknolojisinin geliştirilmesi, genomun düzenlenmesine de izin vermiştir ve mutagenez, nispeten kolaylıkla in vivo gerçekleştirilebilir.^[1]

Radyasyon veya kimyasal mutajenler kullanılarak mutajenezdeki erken girişimler, bölgeye özgü olmayan rastgele mutasyonlar oluşturdu.^[2] Nükleotidlerin analogları ve diğer kimyasallar daha sonra lokalize nokta mutasyonları^[3] oluşturmak için kullanıldı, bu tür kimyasalların örnekleri aminopurin,^[4] nitrosoguanidin^[5] ve bisülfittir.^[6] Alan hedefli mutajenez, 1974 yılında Charles Weissmann'ın laboratuvarında GC'nin AT'ye geçişini indükleyen bir nükleotid analoğu N4-hidroksisitidin kullanılarak gerçekleştirildi.^[7][8] Bununla birlikte, bu mutagenez yöntemleri, elde edebilecekleri mutasyon türüyle sınırlıdır ve daha sonraki alan hedefli mutajenez yöntemleri kadar spesifik değildir.

1971'de Clyde Hutchison ve Marshall Edgell, küçük faj parçaları ϕX174 ve kısıtlama nükleazları ile mutantlar üretmenin mümkün olduğunu gösterdi.^[9][10] Hutchison daha sonra 1978'de iş arkadaşı Michael Smith ile DNA polimeraz ile bir primer uzatma yönteminde oligonükleotidler kullanarak bölgeye yönelik mutajenez için daha esnek bir yaklaşım üretti.^[11] Bu sürecin geliştirilmesindeki rolü için Michael Smith, daha sonra Ekim 1993'te, polimeraz zincir reaksiyonunu icat eden Kary B. Mullis ile Nobel Kimya Ödülü'nü paylaştı.

Temel prosedür, kısa bir DNA primerinin sentezini gerektirir. Bu sentetik primer, istenen mutasyonu içerir ve mutasyon sahası etrafındaki şablon DNA'ya tamamlayıcıdır, böylece ilgilenilen gendeki DNA ile hibridize olabilir. Mutasyon, tek bir baz değişikliği (bir nokta mutasyonu) çoklu baz değişikliği silme veya ekleme olabilir. Tek iplikli primer daha sonra genin geri kalanını kopyalayan bir DNA polimeraz kullanılarak genişletilir. Bu şekilde kopyalanan gen, mutasyona uğramış bölgeyi içerir ve daha sonra bir vektördeki bir konakçı hücreye sokulur ve klonlanır. Son olarak, istenen mutasyonu içerip içermediklerini kontrol etmek için mutantlar DNA dizilemesi ile seçilir.

Tek primerli uzatma kullanan orijinal yöntem, düşük mutant verimi nedeniyle verimsizdi. Ortaya çıkan bu karışım, hem orijinal mutasyona uğramamış şablonu hem de mutant ve mutant olmayan progenlerin karışık bir popülasyonunu üreten mutant ipliği içerir. Ayrıca, kullanılan şablon, mutant iplik metillenmemişken metillenmiştir ve daha az mutantla sonuçlanan metillenmiş şablon DNA'yı destekleyen yanlış eşleşme onarım sisteminin varlığı nedeniyle mutantlar karşı seçilebilir. O zamandan beri, mutagenezin etkinliğini iyileştirmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir.

Yeni teknikler genlere bölgeye özgü mutasyonu sokmanın daha basit ve daha kolay yollarına izin verdiğinden, çoğu 2000'li yılların başından beri laboratuvarlarda nadiren kullanılmasına rağmen, bölgeye yönelik mutagenezi etkilemek için çok sayıda yöntem mevcuttur.^[12]

1985'te Thomas Kunkel, mutantlar için seçme ihtiyacını azaltan bir teknik geliştirdi.^[13] Mutasyona uğratılacak DNA parçası, M13mp18 / 19 gibi bir fajmid içine yerleştirilir ve daha sonra iki enzim dUTPaz (dut) ve urasil deglikosidaz (udg) eksikliği olan bir E. coli suşuna dönüştürülür. Her iki enzim de, bakteri kromozomunu dCTP'nin dUTP'ye spontan deaminasyonu yoluyla mutasyonlardan koruyan bir DNA onarım yolunun parçasıdır. DUTPase eksikliği, hücrede yüksek seviyede dUTP ile sonuçlanan dUTP'nin parçalanmasını önler. Urasil deglikosidaz eksikliği, urasilin yeni sentezlenen DNA'dan uzaklaştırılmasını engeller. Çift mutant E. coli faj DNA'sını kopyaladığından, enzimatik mekanizma dTTP yerine dUTP'yi yanlış birleştirerek bazı urasiller (ssUDNA) içeren tek iplikli DNA ile sonuçlanabilir. SsUDNA, ortama salınan bakteriyofajdan ekstrakte edilir ve daha sonra mutajenez için şablon olarak kullanılır. Primer uzantısı için istenen mutasyonu içeren bir oligonükleotid kullanılır. Oluşan heterodubleks DNA, dUTP içeren bir ebeveyn mutasyona uğramamış zincirden ve dTTP içeren mutasyona uğramış bir zincirden oluşur. DNA daha sonra vahşi tip dut ve udg genlerini taşıyan bir E. coli suşuna dönüştürülür. Burada urasil içeren ebeveyn DNA zinciri bozulur, böylece ortaya çıkan DNA'nın neredeyse tamamı mutasyona uğramış iplikten oluşur.

Diğer yöntemlerden farklı olarak, kaset mutagenezinin DNA polimeraz kullanılarak primer uzatma içermesine gerek yoktur. Bu yöntemde, bir DNA parçası sentezlenir ve daha sonra bir plazmite yerleştirilir.^[14] plazmitdeki bir bölgedeki bir kısıtlama enzimi tarafından bölünmeyi ve ardından ilgili gendeki mutasyonu içeren bir çift tamamlayıcı oligonükleotidin plazmite bağlanmasını içerir. Genellikle plazmit ve oligonükleotitte kesen sınırlama enzimleri, plazmitin yapışkan uçlarına ve birbirine bağlanmasına izin veren aynıdır. Bu yöntem,% 100'e yakın verimlilikte mutantlar üretebilir, ancak mutasyona uğratılacak siteyi çevreleyen uygun kısıtlama alanlarının mevcudiyeti ile sınırlıdır.

Kaset mutagenezinde kısıtlama alanlarının sınırlandırılması, oligonükleotid primerleri ile polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak aşılabilir, böylece iki uygun kısıtlama bölgesini kapsayan daha büyük bir parça üretilebilir. PCR'deki üssel amplifikasyon, daha sonra standart rekombinant moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak orijinal içeriğe eklenebilen jel elektroforezi ile orijinal mutasyona uğramamış plazmitden ayrılacak yeterli miktarda istenen mutasyonu içeren bir fragman üretir. Aynı tekniğin birçok çeşidi vardır. En basit yöntem, mutasyon bölgesini parçanın uçlarından birine doğru yerleştirir, burada parçayı oluşturmak için kullanılan iki oligonükleotitten biri mutasyonu içerir. Bu, tek bir PCR adımını içerir, ancak yine de çok uzun bir primer kullanılmadıkça, mutasyon bölgesinin yakınında uygun bir kısıtlama alanı gerektirme gibi doğal bir soruna sahiptir. Bu nedenle diğer varyasyonlar, üç veya dört oligonükleotit kullanır; bunlardan ikisi, iki uygun kısıtlama bölgesini kapsayan ve sindirilebilen ve bir plazmite bağlanabilen bir fragman oluşturan mutajenik olmayan oligonükleotitler olabilirken, mutajenik oligonükleotit, içindeki bir lokasyona tamamlayıcı olabilir. herhangi bir uygun kısıtlama sitesinden çok uzakta parçalayın. Bu yöntemler, bağlanacak nihai parçanın istenen mutasyonu içerebilmesi için çok sayıda PCR adımını gerektirir. İstenen mutasyona ve ilgili kısıtlama alanlarına sahip bir fragman oluşturmak için tasarım süreci külfetli olabilir. SDM-Assist^[15] gibi yazılım araçları süreci basitleştirebilir.

plazmit manipülasyonları için, diğer bölgeye yönelik mutagenez tekniklerinin yerini, büyük ölçüde, oldukça verimli, ancak nispeten basit kullanımı kolay ve bir kit olarak ticari olarak temin edilebilen teknikler almıştır. Bu tekniklerin bir örneği, bir çift tamamlayıcı mutajenik primerin, pfu polimeraz gibi yüksek kaliteli bir sarmal yer değiştirmeyen DNA polimeraz kullanılarak bir ısıl döngü reaksiyonunda tüm plazmiti büyütmek için kullanıldığı Quikchange yöntemidir.^[16] Reaksiyon, çentikli, dairesel bir DNA oluşturur. Şablon DNA, metillenmiş DNA için spesifik olan DpnI gibi bir kısıtlama enzimi ile enzimatik sindirim yoluyla elimine edilmelidir. Escherichia coli suşlarının çoğundan üretilen tüm DNA'lar metillenecektir, E. coli içinde biyosentezlenen şablon plazmit bu nedenle sindirilecek ve in vitro olarak üretilen ve bu nedenle metillenmemiş olan mutasyona uğramış plazmit sindirilmemiş olarak bırakılacaktır. Bu çift sarmallı plazmit mutajenez yöntemlerinde, ısıl döngü reaksiyonu kullanılabilirken DNA'nın bir PCR'de olduğu gibi üssel olarak çoğaltılmasına gerek olmadığına dikkat edin. Bunun yerine amplifikasyon doğrusaldır ve bu nedenle zincir reaksiyonu olmadığından bunları bir PCR olarak tanımlamak yanlıştır.

Pfu polimerazın daha yüksek uzatma sıcaklığında (≥70 °C) sarmal yer değiştirebileceğini ve bu da deneyin başarısız olmasına neden olabilir, bu nedenle uzatma reaksiyonunun önerilen 68 °C sıcaklıkta gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Bazı uygulamalarda, bu yöntemin çoklu primer kopyalarının eklenmesine yol açtığı gözlemlenmiştir. SPRINP adı verilen bu yöntemin bir varyasyonu, bu artefaktı önler ve bölgeye yönelik farklı mutagenez tiplerinde kullanılmıştır.^[17]

Oligo yönelimli hedeflerin (SMOOT) tarama mutagenezi gibi diğer teknikler, plasmid mutagenezinde mutajenik oligonükleotitleri yarı rastgele birleştirebilir.^[18] Bu teknik, tek mutasyonlardan bütün bir gen boyunca kapsamlı kodon mutagenezine kadar değişen plazmit mutagenez kitaplıkları oluşturabilir.

• Delitto perfetto^[19]
• Yer değiştirme "pop-in pop-out"
• Doğrudan gen delesyonu ve bölgeye özgü mutagenez, PCR ve bir geri dönüştürülebilir işaretleyici ile
• Doğrudan gen delesyonu ve bölgeye özgü mutagenez, PCR ve uzun homolog bölgeler kullanılarak geri dönüştürülebilir bir işaretleyici ile
• Sentetik oligonükleotidlerle in vivo bölgeye yönelik mutagenez^[20]

2013'ten beri CRISPR-Cas9 teknolojisinin geliştirilmesi, çeşitli mutasyonların çok çeşitli organizmaların genomuna verimli bir şekilde dahil edilmesine izin verdi. Yöntem, bir transpozon yerleştirme bölgesi gerektirmez, hiçbir işaret bırakmaz ve etkinliği ve basitliği, onu genom düzenleme için tercih edilen yöntem haline getirmiştir.^[21][22]

Bölgeye yönelik mutajenez, geliştirilmiş veya özel özelliklere sahip rasyonel olarak tasarlanmış bir protein üretebilen mutasyonlar oluşturmak için kullanılır (yani protein mühendisliği).

Araştırma araçları - DNA'daki spesifik mutasyonlar, bir DNA sekansının veya bir proteinin fonksiyon ve özelliklerinin rasyonel bir yaklaşımla araştırılmasına izin verir. Ayrıca, proteinlerdeki bölgeye yönelik mutagenez ile tek amino asit değişiklikleri, çeviri sonrası değişikliklerin önemini anlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, bir substrat proteininde belirli bir serinin (fosfoaseptör) bir alanine (fosfo-alıcı olmayan) değiştirilmesi, bir fosfat grubunun bağlanmasını bloke eder ve böylece fosforilasyonun araştırılmasına izin verir. Bu yaklaşım, CBP proteininin kinaz HIPK2 tarafından fosforilasyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır.^[23] Diğer bir kapsamlı yaklaşım, bir kodonun veya bir dizi kodonun spesifik pozisyonlarda tüm olası amino asitlerle ikame edilebildiği alan doygunluk mutajenezidir.^[24]

Ticari uygulamalar - Proteinler, belirli bir uygulama için uyarlanmış mutant formlar üretmek üzere tasarlanabilir. Örneğin yaygın olarak kullanılan çamaşır deterjanları, vahşi tip formu, işlemdeki proteinin aktivitesini önemli ölçüde azaltan ağartıcı ile oksitlenebilen bir metiyonine sahip subtilisin içerebilir.^[25] Bu metiyonin, alanin veya diğer tortularla değiştirilebilir, bu da onu oksidasyona dirençli hale getirir ve böylece proteini ağartıcı varlığında aktif tutar.^[26]

DNA oligonükleotid sentezinin maliyeti düştüğü için, tam bir genin yapay sentezi artık mutasyonu gen içine sokmak için uygun bir yöntemdir.

Bu yöntem, belirli bir organizma için onu optimize etmek için genin kodon kullanımının tamamen yeniden tasarlanması da dahil olmak üzere, çoklu alanlar üzerinde kapsamlı mutageneze izin verir.^[27]